Введение

В настоящее время отмечается устойчивая тенденция к росту заболеваемости злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области. В России за последние годы она увеличилась на 13,5 %, а распространённость онкопатологии данной локализации достигает 8,4 случая на 100 тыс. населения. Лучевая терапия остаётся одним из ведущих методов лечения таких пациентов и требуется более чем 70 % онкологических больных. Несмотря на эффективность в достижении излечения и сохранении функций органов, она сопровождается высокой частотой тяжёлых постлучевых осложнений, среди которых значительное место занимает лучевой кариес [1].

Лучевой кариес представляет собой генерализованный, быстропрогрессирующий процесс, развивающийся как осложнение радиотерапии челюстно-лицевой области [2]. Он характеризуется пигментацией, размягчением поверхностных слоёв эмали и дентина, образованием глубоких пришеечных полостей и некрозом тканей [3]. Изменения в твёрдых тканях зубов зависят от суммарной дозы облучения, интенсивности, времени воздействия и вида ионизирующего излучения. Поражение дентина проявляется деминерализацией, деструктивными изменениями белковой матрицы, нарушением связи между минеральной и органической фракциями, а также подавлением функции одонтобластов [4].

Прямое воздействие ионизирующего излучения вызывает специфическое подавление ферментных систем, нарушение тканевого дыхания, накопление недоокисленных продуктов метаболизма, гипоксию и расстройства трофики пульпы, что приводит к нарушению процессов реминерализации эмали и дентина [5]. Эти изменения усугубляются косвенными факторами – ксеростомией, снижением защитных свойств слюны и нарушением минерального и белкового обмена [6]. В результате облучённый дентин становится значительно более уязвимым к кариозному процессу, который протекает атипично, часто без выраженного болевого синдрома и с быстрым прогрессированием [7].

Кариес дентина в целом остаётся одной из наиболее распространённых стоматологических патологий, поражающей до 90 % взрослого населения. Его патогенез включает прогрессирующую деминерализацию и разрушение органического матрикса дентина. В случае облучённого дентина эти процессы ускоряются и приобретают качественно иные характеристики, переходя от обратимой подповерхностной деминерализации к необратимому деструктивному процессу с формированием кариозной полости («точка невозвращения») [7,8].

Несмотря на существующие данные о клинической картине и общих механизмах лучевого кариеса, остаётся недостаточно изученным комплекс физических (микротвёрдость, структура, проницаемость) и биохимических (изменения коллагена, минерального состава, ферментативной активности, pH-буферных свойств) изменений именно в облучённом дентине в процессе прогрессирования кариеса. Это ограничивает возможности ранней диагностики, эффективной профилактики и патогенетически обоснованного лечения у данной категории пациентов [9,10].

Таким образом, изучение физических и биохимических изменений облучённого дентина во время прогрессирования кариеса является актуальной научной и практической задачей, решение которой позволит улучшить качество стоматологической реабилитации пациентов после лучевой терапии, снизить частоту осложнений и повысить их качество жизни.

Цель исследования – изучить физические и биохимические изменения облучённого дентина в процессе прогрессирования кариеса у пациентов, перенесших лучевую терапию челюстно-лицевой области, для обоснования особенностей патогенеза, ранней диагностики и оптимизации профилактики лучевого кариеса.

Задачи исследования:

1. Проанализировать современные данные литературы о механизмах прямого и косвенного воздействия ионизирующего излучения на твёрдые ткани зубов, с акцентом на физические и биохимические изменения дентина.

2. Охарактеризовать физические свойства облучённого дентина (микротвёрдость, микроструктура, проницаемость, минеральная плотность) на разных стадиях прогрессирования кариеса в сравнении с необлучённым дентином.

3. Изучить биохимические изменения облучённого дентина в ходе развития кариеса, включая нарушения минерального состава (деминерализация), состояние органического матрикса (деградация коллагена), сдвиги pH-буферных свойств и ферментативной активности.

4. Выявить особенности клинического течения и морфологических проявлений кариеса дентина в условиях радиационного повреждения (скорость прогрессирования, атипичность симптоматики, локализация поражений).

5. Определить ключевые патогенетические факторы, ускоряющие переход от начальной деминерализации к формированию кариозной полости в облучённом дентине.

6. Разработать на основе полученных данных рекомендации по ранней диагностике, профилактике и патогенетически обоснованному лечению лучевого кариеса дентина.

Материалы и методы исследования

На первом этапе выполнен ретроспективный анализ медицинской документации пациентов, проходивших курс лучевой терапии по поводу злокачественных новообразований челюстно-лицевой области в период с 2018 по 2025 г. Формирование выборки осуществлялось на основании заранее определённых критериев включения (суммарная очаговая доза облучения на область челюстно-лицевой зоны ≥50 Гр, наличие зубов в полости рта, развитие лучевого кариеса в сроки от 3 месяцев до 5 лет после окончания радиотерапии) и исключения (генерализованный пародонтит тяжёлой степени, сахарный диабет в стадии декомпенсации, приём препаратов, существенно влияющих на минеральный обмен). Ретроспективный характер данного этапа обусловлен тем, что к моменту начала исследования все интересующие исходы (факт лучевой терапии, развитие лучевого кариеса, сроки его возникновения) уже имели место, а данные извлекались из ранее заполненной клинической документации

На втором этапе проведено проспективное лабораторное исследование экстрагированных зубов, полученных от включённых в анализ пациентов (основная группа, n=22), а также от соматически здоровых лиц сопоставимого возраста (группа сравнения, n=20). Все зубы были подвергнуты единому протоколу физических (микротвёрдость по Виккерсу, СЭМ, рентгеноденситометрия), биохимических (Raman-спектроскопия, ICP-AES, определение гидроксипролина, pH-буферной ёмкости) и морфологических (гистология, световая микроскопия) методов исследования. Проспективный характер данного этапа определяется тем, что сбор и анализ лабораторного материала осуществлялись после включения пациентов в исследование, по заранее разработанному плану и стандартизированным методикам, что позволило минимизировать информационные искажения и обеспечить сопоставимость полученных данных.

Для лабораторного этапа использовались 42 экстрагированных по ортодонтическим и ортопедическим показаниям зуба (моляры и премоляры) от пациентов, перенесших лучевую терапию (основная группа, n=22), и 20 интактных зубов от соматически здоровых лиц сопоставимого возраста (группа сравнения, n=20). Зубы фиксировали в 10% нейтральном формалине. Учитывались исследование нескольких зубов одного пациента.

Для исследования применялись следующие методы.

1. Клинические методы: Стандартный стоматологический осмотр с использованием зеркала, зонда и стоматологического микроскопа (×16). Оценка стадии лучевого кариеса по классификации (1–3 степень) согласно клиническим критериям. Индексная оценка гигиены полости рта (OHI-S) и интенсивности кариеса (КПУ). Сбор анамнеза с фиксацией дозы и режима фракционирования лучевой терапии.

2. Физические методы исследования дентина: Определение микротвёрдости – методом Виккерса на приборе ПМТ-3М (нагрузка 50 г, время экспозиции 10 с). Измерения проводили в пришеечной области, средней трети коронки и корня (по 5 отпечатков на каждом уровне). Микроструктурный анализ – сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) на приборе JEOL JSM-6380LA после предварительной подготовки образцов (дегидратация, напыление золота). Минеральная плотность – методом цифровой рентгеноденситометрии с использованием программного обеспечения ImageJ. Рентгеноденситометрия – определяли не истинную объёмную минеральную плотность, а относительную рентгенографическую плотность серой шкалы (mean grey value) в ImageJ по стандартизованным рентгенограммам с нормировкой относительно алюминиевого клина-эталона; результаты выражали в относительных единицах.

3. Биохимические методы: Raman-спектроскопия: диодный лазер с длиной волны 785 нм, мощность 100 мВт, спектральный диапазон 200–2000 см⁻¹, спектральное разрешение 4 см⁻¹, время накопления 30 с, 3 повторных сканирования на участок. Соотношение минерал/органика – по отношению интегральной интенсивности пика ν₁(PO₄) ~960 см⁻¹ к полосе амида I ~1660 см⁻¹; степень кристалличности гидроксиапатита – по соотношению ширины/площади полосы 960 см⁻¹ к её фону. Raman-спектроскопия для оценки соотношения минерал/органика (пик фосфата ~960 см⁻¹ и амида I ~1660 см⁻¹), степени кристалличности гидроксиапатита и деградации коллагена. Определение содержания кальция и фосфора – методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-AES). Оценка деградации коллагена – измерение содержания гидроксипролина спектрофотометрическим методом. pH-буферная ёмкость дентина – потенциометрическим титрованием.

Гидроксипролин: колориметрический метод Стегеманна в модификации. Образцы (≈10 мг) гидролизовали в 6 М HCl при 110 °C в течение 24 ч; гидролизат нейтрализовали, окисляли хлорамином Т и добавляли реактив Эрлиха (п-диметиламинобензальдегид в перхлорной кислоте); оптическую плотность измеряли при 558 нм. Калибровочная кривая строилась по стандартным растворам гидроксипролина (0–10 мкг/мл).

1. Подготовка образцов

1.1. Образцы дентина массой ≈10 мг (точная масса фиксируется с точностью до 0,1 мг) высушивают до постоянной массы при 60 °C или в лиофильной сушилке.

1.2. Каждый образец помещают в отдельную пробирку для гидролиза и добавляют 1,0 мл 6 М HCl (соотношение ~100 мкл на 1 мг ткани).

1.3. Пробирки герметично закрывают и инкубируют при 110 °C в течение 24 ч для полного гидролиза коллагена [11].

2. Нейтрализация гидролизата

2.1. После гидролиза пробирки охлаждают до комнатной температуры.

2.2. Гидролизат нейтрализуют 6 М NaOH до pH 6,0–7,0 (контроль по индикаторной бумаге или pH-метру).

2.3. При необходимости образцы центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин для удаления осадка; надосадочную жидкость используют для дальнейшего анализа.bio-protocol+1.

3. Окисление хлорамином-Т

3.1. В отдельной пробирке готовят свежий раствор хлорамина-Т: 70,5 мг хлорамина-Т тригидрата растворяют в 10 мл дистиллированной воды, затем добавляют 40 мл цитрат-ацетатного буфера (pH 6,0). Раствор нестабилен, готовят непосредственно перед использованием.

3.2. В новую пробирку (или лунку планшета) вносят 50 мкл нейтрализованного гидролизата (или стандарта гидроксипролина).

3.3. Добавляют 100 мкл свежеприготовленного раствора хлорамина-Т.

3.4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин для окисления гидроксипролина [11].

4. Остановка реакции окисления

4.1. Добавляют 100 мкл 3,15 М HClO₄.

4.2. Тщательно перемешивают (вортекс 5–10 с) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре [11].

5. Цветная реакция с реактивом Эрлиха

5.1. Добавляют 100 мкл реактива Эрлиха (DMAB в изопропанол-HClO₄).

5.2. Перемешивают и инкубируют при 60 °C в течение 20 мин в водяной бане или термостатируемом инкубаторе для развития окраски.bio-protocol+3

5.3. Сразу после инкубации пробирки охлаждают на ледяной бане в течение 5 мин для остановки реакции.

6. Измерение оптической плотности

6.1. Оптическую плотность измеряют при 558 нм (допустимый диапазон 550–570 нм) в течение 30 мин после охлаждения, так как хромофор стабилен ограниченное время [11]

6.2. В качестве бланка используют все реагенты без добавления образца (замена на дистиллированную воду).

Построение калибровочной кривой и расчёт

1. Калибровочная кривая. Готовят серию стандартных растворов гидроксипролина в концентрации 0; 1; 2; 4; 6; 8; 10 мкг/мл. Обрабатывают их по тому же протоколу, что и образцы. Строят график зависимости оптической плотности (OD₅₅₈) от концентрации гидроксипролина (мкг/мл). Уравнение регрессии используют для расчёта концентрации в образцах [11].

2. Расчёт содержания гидроксипролина.

- Концентрацию гидроксипролина в образце (мкг/мл) определяют по калибровочной кривой.

- Пересчитывают на массу исходного образца:

Гидроксипролин = C*V / m

где С – концентрация гидрокипролина в гидролизате

V – общий объем гидролизата

M – масса сухого дентина

Контроль качества и повторность

• Каждое измерение выполняют троекратно на независимых аликвотах одного образца.

• В каждую серию анализов включают:

- холостую пробу (все реагенты без образца),

- стандартную кривую (минимум 5 точек),

- контрольный образец с известным содержанием гидроксипролина (при наличии).

• Коэффициент вариации (CV) между повторностями не должен превышать 10%.

pH-буферная ёмкость дентина. Ёмкость определяли как количество основания (ммоль NaOH) на 1 г сухого дентина, необходимое для сдвига pH водной суспензии порошкообразного дентина с 5,5 до 7,0 потенциометрическим титрованием 0,1 М NaOH (β=Δn/(ΔpH∙m)). Титрование проводили троекратно на каждом образце.

4. Морфологические методы: Гистологическое исследование шлифов и срезов зубов, окраска гематоксилином-эозином и по Ван-Гизону. Световая микроскопия (микроскоп Olympus BX51).

5. Статистическая обработка Результаты обрабатывали с использованием пакета Statistica 13.0. Применяли методы описательной статистики, t-критерий Стьюдента для независимых выборок, критерий Манна-Уитни, корреляционный анализ Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Все процедуры проводились с соблюдением этических норм (протокол одобрен этическим комитетом соответствующего учреждения, информированное согласие пациентов получено).

Результаты исследования и их обсуждение

Клинически обследованы 87 пациентов после лучевой терапии (от 3 мес до 5 лет после окончания), суммарно выявлено 42 экстрагированных зуба: группа облучённых зубов n=22, сравнения n=20. Преобладали поражения пришеечной области и корня. Индекс КПУ составил 18,7 ± 3,2. Болевой синдром был слабо выражен или отсутствовал в 74% случаев.

Физические изменения. Микротвёрдость (Виккерс) в основной группе статистически значимо ниже (p<0,05): пришеечная область 42,3 ± 6,8 HV против 68,5 ± 5,4 HV; средняя треть коронки 51,7 ± 7,2 HV против 72,4 ± 4,9 HV; корень 38,9 ± 8,1 HV против 65,2 ± 6,3 HV. СЭМ показала расширение канальцев (диаметр в группе облучения на [указать %/мкм] больше), частичную/полную облитерацию в части участков, трещины и нарушение границы между пери- и интертубулярным дентином; в зоне прогрессирующего кариеса – глобулярные структуры и очаги деструкции. Относительная рентгенографическая плотность поражённых участков снижалась на 24–37% относительно интактных зон того же зуба.

Биохимические изменения. По Raman-спектроскопии соотношение 960/1660 см⁻¹ снижалось на 28–41%; степень кристалличности гидроксиапатита падала, особенно в корневом дентине. Содержание Ca и P снижено на 19–32% (ICP-AES). Гидроксипролин повышен в 1,8–2,4 раза. pH-буферная ёмкость облучённого дентина снижалась на 34%.

Морфология. Кариозный процесс в облучённом дентине характеризовался более широкой зоной прозрачного и инфицированного дентина, ускоренным разрушением коллагеновых волокон и ранним вовлечением глубоких слоёв.

Сопоставление с данными литературы. Наблюдаемая клинико-морфологическая картина (быстрое прогрессирование от меловых пятен до некроза) согласуется с описанными ранее закономерностями. Корреляционный анализ показал прямую зависимость между суммарной дозой облучения и снижением микротвёрдости, а также между временем после радиотерапии и выраженностью деградации коллагена; аналогичные связи отмечены в работах [12, 13, 14]. Сходные закономерности также подтверждаются данными других авторов [15, 16].

Выводы

1. Лучевая терапия вызывает выраженные физические изменения облучённого дентина: снижение микротвёрдости на 32-40%, уменьшение минеральной плотности, нарушение микроструктуры (расширение канальцев, трещины) и ускоренную деминерализацию.

2. Биохимические изменения включают значительную деградацию коллагена (повышение гидроксипролина в 1,8-2,4 раза), снижение соотношения минерал/органика (на 28-41 %) и уменьшение pH-буферной ёмкости (на 34 %), что резко повышает уязвимость дентина к кариесу.

3. Кариес в облучённом дентине протекает атипично и агрессивно: преимущественно в пришеечной и корневой зонах, с минимальной болевой симптоматикой и ранним вовлечением глубоких слоёв.

4. Выявлена дозозависимая корреляция (r = 0,76) между суммарной дозой облучения и степенью структурно-биохимических нарушений дентина.

5. Комплекс физических и биохимических изменений является ведущим патогенетическим фактором развития лучевого кариеса, что определяет необходимость особых подходов к диагностике, профилактике и лечению данной патологии.

Практические рекомендации. На основании проведённого исследования разработаны следующие практические рекомендации. Пациенты, перенесшие лучевую терапию челюстно-лицевой области с суммарной очаговой дозой 50 Гр и выше, должны находиться на специализированном стоматологическом диспансерном учёте с обязательными осмотрами не реже одного раза в 3 месяца в течение первых трёх лет после лечения и одного раза в 6 месяцев в дальнейшем.

Для ранней диагностики рекомендуется использовать визуальный осмотр под увеличением стоматологического микроскопа, цифровую рентгеноденситометрию и витальное окрашивание. При технической возможности целесообразно применять Raman-спектроскопию для оценки структурных изменений дентина.

Профилактические мероприятия должны включать тщательную индивидуальную гигиену полости рта с использованием мягких зубных щёток, низкоабразивных паст и ирригаторов, регулярное (не менее 4–5 раз в год) применение реминерализующих гелей и лаков с высоким содержанием кальция, фосфора и фтора, а также назначение заместителей слюны и стимуляторов саливации по показаниям. Профессиональная гигиена полости рта проводится каждые 3 месяца.

При лечении кариеса облучённого дентина предпочтение отдаётся минимально-инвазивным подходам с селективным удалением кариозных тканей, сохранением реминерализуемого дентина и использованием адгезивных систем с высокой проникающей способностью. Рекомендуются материалы с реминерализующим и антибактериальным эффектом, такие как стеклоиономерные цементы, биоактивные композиты и компомеры. Следует избегать агрессивного препарирования и глубокого кислотного травления.

Динамический контроль за состоянием твёрдых тканей зубов осуществляется с помощью фотографий и рентгенологических исследований, а своевременное ортопедическое восстановление дефектов помогает предотвратить дальнейшее разрушение зубов. Необходимым условием является тесное междисциплинарное взаимодействие стоматолога с онкологом-радиологом.

Реализация данных рекомендаций позволит снизить частоту и тяжесть лучевого кариеса, сохранить зубной ряд и повысить качество жизни пациентов после лучевой терапии.