science-review.ru
Окислительный стресс является одной из основных причин структурных изменений, происходящих с белковыми молекулами в крови. Плазменные белки при действии избыточного количества свободнорадикальных соединений первыми вовлекаются в процессы окислительных изменений, имеют значительный период полураспада, их устойчивость к воздействию других биомолекул относительно высока, для них отсутствуют специфические рецепторы, позволяющие им активно переходить из крови в клетки, и поэтому рассматриваются как значимый и надежный маркер оксидативного статуса организма при возникновении различных заболеваний [1]. Способом реализации окислительной модификации белков являются реакции карбонилирования белков преимущественно по остаткам треонина, пролина, гистидина, лизина. В результате возникают необратимые ковалентные изменения белковых молекул. До определенного уровня выраженности и интенсивности процесс окислительных изменений белковых молекул носит физиологический характер. Он необходим для удаления и деградации протеинов с наличием структурных нарушений при участии лизосом, а также в ходе функционирования протеасомного механизма. При достижении определенного уровня выраженности окислительная модификация белков приобретает патологическую направленность.
Реализация токсических эффектов этанола и ацетальдегида при злоупотреблении алкоголем может быть осуществлена посредством окисления белковых молекул. Алкоголь-индуцируемая генерация кислородных радикалов и повышение интенсивности липопероксидации при алкоголизме могут быть причиной изменения структуры белков, приводящей к нарушению механизмов действия сигнальных молекул, функционирования транспортных, ферментных систем, работы рецепторов [2].
Вполне вероятно, что данные нарушения могут проявляться в виде различных метаболических сдвигов и находить отражение в клинической симптоматике при формировании алкогольной абстиненции. Детальная оценка параметров окислительной модификации белков плазмы крови в различные сроки развития алкогольного абстинентного синдрома может способствовать уточнению и более глубокому пониманию нарушений молекулярных и биохимических событий при алкоголизме.
В связи с этим с целью оценки окислительной модификации белков в первые сутки развития алкогольного абстинентного синдрома было проведено исследование содержания в плазме крови больных алкоголизмом алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов.
Материалы и методы исследования
В число обследуемых вошли пациенты с диагнозом «Психические и поведенческие расстройства в результате употребления алкоголя, средняя стадия. Синдром активной зависимости. Состояние отмены, неосложненное, средней степени тяжести» (F.10.242, F.10.302), выборка которых была сформирована в соответствии с критериями включения и исключения.
Критерии включения: возраст 35–50 лет; состояние алкогольной абстиненции при поступлении в стационар; информированное согласие пациента (или его родственников) на проведение исследования. Критерии исключения: наличие аллергических, эндокринных или других заболеваний, способных оказать влияние на течение основного заболевания и результат исследования; приём других наркотических и психотропных средств; отказ от участия в исследовании (по результатам беседы с пациентом или его родственниками).
С использованием этих критериев была сформирована группа больных, у которых взятие крови для исследования проводилось в первые сутки (группа ААС1, n = 9) после поступления в стационар. Группу сравнения (группа К, n = 10) составили условно здоровые лица аналогичной возрастной категории. Купирование абстинентных расстройств проводилось обычными медикаментозными средствами (дезинтоксикация, седативная терапия, витаминотерапия).
Уровень спонтанной окислительной модификации белков в крови оценивали по образованию алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов [3].
Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью компьютерных программ AnalystSoft Inc., Statplus (версия 5) и Microsoft Excel. В качестве основных характеристик описательной статистики применяли медиану (Ме), нижний 25-й (L) и верхний 75-й (Н) квантили. Оценку статистической значимости различий проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (U) для двух независимых выборок.
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке уровня алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов в крови пациентов с алкогольным абстинентным синдромом статистически значимых изменений не обнаружено. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов в группе ААС1 составило 276,7 (226,1; 319,3) ЕДоп/г белка. ЕДоп – единицы оптической плотности. В группе сравнения уровень данного параметра был равен 289,8 (268,4; 444,3) ЕДоп/г белка.
Индикация структурных изменений протеинов, связанных с развитием заболеваний, в патогенезе которых отводится значительное место свободнорадикальным веществам, может быть осуществлена при оценке параметров окислительной модификации белковых молекул в различных тканях и биологических жидкостях. Оценка данных показателей в условиях патологии позволяет говорить о том, что их устойчивость к воздействиям других молекул высока, а вовлеченность в химические процессы в тканях и крови – низкая. Это обстоятельство определяет надёжность показателей окислительной модификации белков в аспекте диагностики окислительного стресса.
Динитрофенилгидразоны представляют собой соединения, которые образуются в результате взаимодействия окислительно-модифицированных белков с 2,4-динитрофенилгидразином. Считается, что при окислительной модификации белков происходят различные конформационные изменения структуры протеинов, связанные с влиянием веществ свободнорадикальной природы. Предположительно роль инициаторов окислительной модификации белков выполняют: а) продукты липопероксидации; б) активные кислородные метаболиты; в) ионы двухвалентного железа.
Соединение продуктов перекисного окисления липидов с радикалами аминокислот (цистеин, лизин, гистидин) в белковых молекулах составляет один из возможных способов реализации окислительных изменений в протеинах. Также вероятным вариантом может быть воздействие химически агрессивных радикалов кислорода с формированием карбонильных производных белков. Немаловажным моментом является существование процесса металл-катализируемого окисления белков. Так, влияние солей железа и меди – это причина образования гидроксильного радикала, вызывающего формирование карбонильных производных белков.
В то же время представляется, что главными инициирующими факторами изменения структуры белков окислительного характера являются активированные кислородные метаболиты [4]. В плане химического воздействия с развитием молекулярных последствий в виде образования белковых агрегатов наиболее мощным считается гидроксильный радикал. Фундаментальные исследования Davies К. et al. (1987) по оценке стабильности протеиновых структур крови электрофоретическим методом, а также изучение уровня формирования агрегационных продуктов, проведённое с измерением молекулярной массы, показали значительное повреждение многих белков под влиянием гидроксильного радикала.
Окислительным изменениям структуры белковых молекул подвержены практически все аминокислотные радикалы. По данным Дубининой Е.Е. и соавт. (1993), указанные изменения приводят к трансформации физико-химических свойств протеинов: а) в сторону повышения склонности к образованию агрегатов, или наоборот; б) тенденции к формированию коротких белково-пептидных веществ (фрагментация); в) уменьшение количества гидрофильных аминокислотных последовательностей; г) увеличение подверженности протеолитической ферментативной деградации.
Кроме того, видится весьма вероятным снижение каталитической активности ферментов в результате окислительных модификаций их молекул с многочисленными негативными метаболическими последствиями. Это связано с реакциями окисления, в которые вступают функциональные группы аминокислот активных центров ферментов. Их структурная модификация определяет изменение ферментативной активности. Определенные ферменты класса оксидоредуктаз полностью теряют свою активность в результате воздействия на активный центр гидроксильного радикала.
Нарушение структуры митохондриальных белков из-за активации окислительных реакций с участием аминокислот, входящих в состав протеинов митохондриальных мембран, выражается в развитии гипоэнергетического состояния.
Избыточное образование и сохранение в клетках окислительно-модифицированного протеина обуславливает возможность формирования дополнительных поперечных «сшивок» как внутри молекулы белка, так и между отдельными белковыми субъединицами, что определяет утрату свойств белковых молекул.
Максимально подвержены действию свободных радикалов аминокислоты, содержащие в своем составе серу (цис, мет) и бензольное кольцо (фен, тир, три). Соответственно, свободнорадикальное изменение структуры белков сопровождается появлением тиильных радикалов, радикалов ароматических аминокислот, углеродных радикалов, радикальных форм, содержащих азот.
Алкоголь-индуцированные структурные изменения затрагивают белки различных тканей [5]. В результате этого белковые молекулы могут претерпевать следующие изменения: взаимодействие липидных перекисей с аминокислотными остатками гистидина, лизина, цистеина в составе белков; окисление с образованием карбонильных производных белков; окисление с образованием дисульфидов и серосодержащих кислот, гликозилирование протеинов, глиоксидация с участием остатков аспарагиновой кислоты и лизина.
В экспериментальных исследованиях Bailey S. et al. (2001) при моделировании хронической алкогольной интоксикации показано увеличение карбонильных производных белков в цитозольной и митохондриальной фракциях ткани печени. В работе [6] отмечено увеличение интенсивности ацетилирования. Shringarpure R. et al. (2002) выявили активацию пропионилирования митохондриальных белков при воздействии этанола. Kim H. et al. (2006) показали, что уровень окислительно-модифицированных белков при воздействии этанола повышен в нервных структурах, ткани легких, плазме крови.
Установлено повышение карбонильных производных белков при развитии алкогольного абстинентного состояния, осложнённого делирием. Авторами подчёркивается значимость влияния длительности и тяжести заболевания на исследуемые показатели [7; 8]. При хронической алкогольной интоксикации в плазме крови и эритроцитах Grattagliano I. et al. (1995) выявлено существенное изменение редокс-статуса белковых молекул в сторону увеличения окисленных форм. Данные положительно коррелируют с низким уровнем восстановленного глутатиона, повышением активности прооксидантных ферментов.
Алкоголь-ассоциированное поражение печени с развитием цирротических изменений также может являться одной из причин модификации уровня карбонилированных производных белков согласно данным иммуногистохимического, масс-спектрометрического и блоттингового анализа. Более 400 уникальных, специфичных для алкогольной патологии видов измененных белков выделено в условиях триггеризации окислительного стресса. При детальном изучении механизмов данного процесса определили взаимосвязь длительного, хронического потребления этанола с увеличением уровня карбонилирования белков в посттрансляционный период. Стоит отметить мнение авторов об обусловленности нарушений в аспекте изменения глутатионового гомеостаза и гликолитических процессов при алкоголизме [9].
По данным других исследователей, изменений показателей, отражающих оксидативную модификацию белкового статуса в крови при алкогольном абстинентном синдроме, по сравнению с группой условно здоровых лиц не наблюдается [10].
Принято считать, что алифатические альдегид-динитрофенилгидразоны – это продукты окисления триптофана, аргинина, лизина, пролина, являющиеся ранними маркерами окислительной деструкции белка и отражающие степень деструкции белков по типу фрагментации. Модификация белков по типу фрагментирования может быть связана с действием радикальных форм липидов, выявляемым при различных формах алкогольной интоксикации.
Недостаточность и дефекты ферментативной антиоксидантной активности в отношении продуктов липидной пероксидации являются причиной усиления окислительных изменений белковых молекул. Так, в исследовании хронического действия этанола на мышах, «нокаутированных» по гену фермента глутатион-S-трансферазы А4-4, проявляющего высокую каталитическую эффективность относительно продуктов липопероксидации и реактивных альдегидов, выявлено повышение уровня карбонилированных белков [9].
Возможный механизм, объясняющий полученные данные об уровне продуктов окислительной модификации белков в плазме крови при алкогольной абстиненции, может быть связан с повышением активности протеасомального пути деградации белков. Превалирующая 20S-форма протеасом более избирательна к процессу лизиса ковалентно модифицированных и белков с ошибками фолдинга [11].
Другой вероятной причиной результатов исследования видится значительная активация окислительной модификации белков вследствие предшествующей развитию абстинентного состояния алкогольной интоксикации. Результатом этого может явиться формирование количественного недостатка субстратов для процесса карбонилирования.
Кроме того, необходимость устранения метаболических сдвигов, отмеченная Zhenqi L. et al. (2002), при отмене алкоголя сопровождается первоочередным использованием аминокислот и белков крови, мышечной и других тканей и подтверждается результатами наших предыдущих исследований, свидетельствующих об увеличении активности гаммаглутамилтрансферазы в ткани печени при моделировании алкогольной абстиненции.
Результаты оценки окислительной модификации белков крови по уровню алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов могут быть связаны с преимущественным действием активных форм кислорода на полиненасыщенные высшие жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов клеточных мембранных образований, что обеспечивает сохранность белков.
Также механизмом, определяющим отсутствие статистически значимых изменений оцениваемых параметров, представляется действие компонентов антиоксидантной системы клеток. Так, оценка эффективности функционирования каталазы при исследовании влияния этанола в дрожжевых клетках, проведенная Lushcha К. et al. (2003), показала защитные свойства данного фермента в отношении образования окислительно-модифицированных форм белковых молекул.
Выводы
Обобщая указанные факты, можно сделать выводы о том, что отсутствие значимых изменений уровня алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов в крови больных алкоголизмом при развитии абстинентного состояния может быть связано с:
1) недостатком субстратов для окислительной модификации, который сопряжен с активным использованием белков в процессе метаболической адаптации, а также усилением их вовлеченности в свободнорадикальные процессы в ходе предшествующей алкогольной интоксикации;
2) усилением процессов внутриклеточной деградации белковых молекул, которая интенсифицируется из-за окислительных изменений в структуре белков;
3) возможным преимущественным влиянием свободнорадикальных субстанций на полиеновые высшие жирные кислоты фосфолипидов мембран клеток;
4) эффективным функционированием ферментативной составляющей антиоксидантной системы.