science-review.ru
Чтобы получить новую классификацию рака, которая может изменить терапевтические режимы, рак молочной железы (РМЖ) был тщательно изучен на геномном и транскриптомном уровнях [1]. Три основных классических подтипа определяются экспрессией рецептора эстрогена (РЭ), рецептора прогестерона (РП); гормональноположительный рак молочной железы) и рецептора эпидермального фактора роста ErbB2/Her2 (Her2-положительный). Тройная отрицательная форма (TН) (где не экспрессируется ни один из трех маркеров) имеет особенно плохой прогноз. Совсем недавно непредвзятые подходы, такие как анализ РНК-мессенджера (мРНК) и анализ вариаций числа копий генов, выявили новые классы, основанные на полном молекулярном профиле. Первоначально C.M. Perou и др. (2000) профилированные паттерны экспрессии генов десятков опухолей молочной железы и идентифицировали так называемые «внутренние подтипы» РМЖ, которые были усилены в многочисленных исследованиях с некоторыми модификациями [2, 3]. Эти подтипы развились в четыре общепринятых подтипа: люминальный А, люминальный В, обогащенный Her2 и базальный рак молочной железы. Хотя они не полностью отражают клинические подтипы, большинство опухолей являются РЭ / РП положительными. Большинство опухолей, обогащенных Her2, содержат амплификацию гена, а большинство базальных опухолей являются тройными отрицательными. Крупномасштабное комплексное геномно-транскриптомное исследование дополнительно разделило эти подтипы на 10 кластеров, однако они еще не были приняты клинически [4].
Цель исследования – изучить протеомный профиль при раке молочной железы на основе литературных данных.
Материалы и методы исследования
Проведен систематический обзор литературы в базе данных Pubmed, Medline, Kohrain library и др., где ключевыми словами поиска явились: рак молочной железы, подтипы, молекулярная классификация, белки, гены, биомаркеры, РНК. Поиск охватывал последние исследования за 10 лет.
Результаты исследования и их обсуждение
Используя подход, основанный на изучении белков, исследователи используют количественную протеомику для изучения функциональных сетей в рамках установленных подтипов РМЖ. Некоторые пришли к выводу, что анализ на уровне белка, а не генов и транскриптов может более непосредственно отражать клеточные функции. В сравнении с геномными данными авторы ранее показали низкую корреляцию между числом копий гена в геноме и относительными изменениями на уровнях белка, что означает, что многие геномные вариации не транслируются или только частично транслируются на уровень белка [5]. Кроме того, также было обнаружено, что корреляция между уровнями мРНК и белка далека от совершенства, поэтому изучение только мРНК не обязательно отражает активные клеточные функции [6]. Количественный протеомный анализ в масштабе генома только сейчас становится возможным благодаря многочисленным достижениям в области базовой технологии, вычислительных алгоритмов и биохимических технологий. Например, высокоскоростные масс-спектрометры с высоким разрешением в сочетании с передовыми вычислительными методами теперь могут обеспечить глубокое покрытие протеома с высокой степенью достоверности идентификации белков [7]. Для точного количественного определения используют стабильную изотопную маркировку аминокислотами в технологии культивирования клеток (SILAC), которая включает метаболическую маркировку клеток лизином и аргинином. Пептиды, образующиеся в результате триптического расщепления, маркируются в «легкой» (нормальной изотопной) или «тяжелой» (меченной стабильными изотопами) форме, и каждый из этих пептидных дублетов способствует количественному определению белка [8].
Stefka Tyanova и др. (2016) проанализировали панель из сорока образцов РМЖ, состоящую из 14 положительных случаев рецептора эстрогена и/или рецептора прогестерона, 15 положительных Her2 и 11 TН опухолей. Были использованы методы иммуногистохимии и флуоресцентной гибридизации in situ FISH. Из общего набора 37 были протоковыми карциномами и три дольковыми; большинство опухолей были I–II стадии. Только две опухоли экспрессировали как Her2, так и РЭ, и поэтому могут рассматриваться как люминальные B типы. Для протеомного анализа авторы использовали две технологии: первая, FFPE-подготовка образцов с фильтром (FASP), которая позволяет извлекать белок из тканей FFPE. Второй, super-SILAC, использует смесь клеток, меченных SILAC, в качестве стандарта, что позволяет проводить точную количественную оценку опухолевых протеомов. Анализ предоставил самый большой набор протеомных данных по опухоли молочной железы, содержащий в общей сложности 157 544 идентифицированных пептидов, уникальных по последовательности и 10 135 идентифицированных белков с частотой ложных обнаружений 1 %, как по соответствию пептидного спектра, так и по уровням белка. В среднем они идентифицировали >7000 белков в каждом образце, охватывающих 8 порядков интенсивности сигнала. Интересно, что 95 % белков находились в гораздо более узком диапазоне численности на четыре порядка, и они все еще включали важные факторы транскрипции, такие, как JUN и ATF2. Эти результаты представляют собой общесистемное количественное представление протеомов клинических образцов, которое послужило основой для дальнейшего последующего вычислительного анализа и биологической интерпретации [9, 10].
Человеческий ген, связанный с CTD 1 (С-terminal domen) ассоциированным фактором (SCAF1-сплайсинг фактором), является новым членом человеческого суперсемейства SR (Ser/Arg-rich) факторов сплайсинга пре-мРНК. SCAF1 взаимодействует с доменом CTD полипептида A РНК-полимеразы II и активно участвует в сплайсинге пре-мРНК. Хотя было обнаружено, что он широко экспрессируется во многих тканях человека, уровни его мРНК сильно различаются. Значительная связь SCAF1 с раком была подтверждена многими исследованиями, поскольку было обнаружено, что транскрипт мРНК SCAF1 сверхэкспрессируется в опухолях молочной железы и яичников, подтверждая его значительную прогностическую ценность в качестве биомаркера рака при обоих этих злокачественных новообразованиях. P.G. Adamopoulos и др. (2018) описали открытие и клонирование пятнадцати новых транскриптов человеческого гена SCAF1 с использованием технологии вложенной ПЦР. Биоинформационный анализ показал, что эти новые варианты сплайсинга SCAF1 содержат в общей сложности девять новых альтернативных событий сплайсинга между аннотированными экзонами гена, таким образом, образуя семь новых транскриптов SCAF1 с открытыми рамками считывания, которые, по прогнозам, будут кодировать новые изоформы SCAF1 и восемь новых транскриптов SCAF1 с кодонами преждевременного завершения, которые, вероятно, являются длинными некодирующими РНК. Поскольку SCAF1 участвует во многих злокачественных новообразованиях человека, квалифицируясь как потенциальный биомаркер, количественная оценка представленных новых транскриптов в образцах человека может иметь клиническое применение при различных типах рака [11].
Толерантность к тяжелому микроокружению опухоли, включая гипоксию и недостаток питательных веществ, является общей чертой агрессивных раковых клеток. Однако метаболические изменения, которые поддерживают раковые клетки при недостатке питательных веществ, недостаточно изучены. Показано, что лишение глутамина приводит к накоплению фосфоэтаноламина (PETN) в раковых клетках посредством подавления цитидилилтрансферазы PETN (PCYT2), фермента, ограничивающего скорость биосинтеза фосфатидилэтаноламина. Накопление PETN коррелировало с ростом опухоли при недостатке питательных веществ. Подавление PCYT2 было частично опосредовано подавлением транскрипционного фактора ELF3. Кроме того, сверхэкспрессия PCYT2 снижала уровни PETN и рост опухоли. Кроме того, накопление PETN и снижение регуляции PCYT2 в опухолях молочной железы человека коррелировали с плохим прогнозом. Таким образом, установлено, что лишение глютамина приводит к прогрессированию опухоли, регулируя биосинтез PE через ось ELF3-PCYT2. Кроме того, манипулирование генами, чувствительными к глютамину, может быть терапевтическим подходом для ограничения прогрессирования рака [12, 13].
Примерно 70 % случаев РМЖ являются эстроген-положительными и лечатся с помощью эндокринной терапии. Широко используемое лечебное средство, тамоксифен, демонстрирует высокую эффективность для улучшения прогноза. Однако примерно у трети пациентов, получающих тамоксифен, развивается резистентность к этому препарату. Oh J.H. и др. (2020) исследовали функцию общего контроля, ген ацетилтрансферазу (GCN5), и его нижестоящих эффекторов при РМЖ, резистентном к тамоксифену. Клетки РМЖ поддерживали высокие уровни GCN5 из-за его ослабленной протеасомной деградации. Повышенная экспрессия GCN5 усиливала экспрессию при РМЖ, что приводило к снижению стабильности р53 и устойчивости к тамоксифену. И наоборот, чувствительность клеток MCF7, сверхэкспрессирующих GCN5, к тамоксифену была восстановлена путем принудительной экспрессии р53. Исследование in vivo продемонстрировало положительную корреляцию между GCN5 и AIB1 и их вкладом в устойчивость к тамоксифену. Авторы пришли к выводу, что GCN5 способствует экспрессии AIB1 и резистентности к тамоксифену при РМЖ за счет снижения уровня р53, что позволяет предположить полезность GCN5 и его нижестоящих эффекторов в качестве терапевтических мишеней для предотвращения или преодоления резистентности к тамоксифену при РМЖ [14].
Устойчивость к химиотерапии и лучевой терапии считается основным терапевтическим барьером при РМЖ. Раковые стволовые клетки (РCК) играют важную роль в устойчивости к химиотерапии и лучевой терапии. Установленная химио- и радиорезистентная клеточная линия тройного негативного РМЖ (ТНРМЖ) MDA-MB-231/IR демонстрирует более высокие характеристики РСК, чем родительские клетки MDA-MB-231. Все больше доказательств свидетельствует о том, что метадерин связан с рядом сигнальных путей рака, а также с устойчивостью к терапии РМЖ, что делает его привлекательной терапевтической мишенью. Анализ выживаемости выявил корреляцию между более высокими уровнями метадерина и более короткой продолжительностью жизни у пациентов с РМЖ и ТНРМЖ. Более того, в базе данных Cancer Genome Atlas по РМЖ была выявлена положительная корреляция между уровнями экспрессии метадерина и CD44. Y.T.-K. Nguyen и др. показали, что метадерин играет ключевую роль в регуляции гемопоэза в клетках MDA-MB-231/IR. Нокдаун метадерина в клетках MDA-MB-231/IR приводил к снижению популяции РСК, активности альдегиддегидрогеназы и основных маркеров РСК, включая β-катенин, CD44+ и Slug. Кроме того, нокдаун метадерина повышал уровни активных форм кислорода (АФК) в клетках MDA-MB-231/IR. Они обнаружили, что фенэтилизотиоцианат (PФЭТЦ), хорошо известный фитохимический антиоксидант, подавляет пролиферацию в клетках MDA-MB-231/IR посредством модуляции АФК посредством подавления метадерина. Совместное лечение фенэтилизотиоцианатом и N-ацетилцистеином (поглотителем АФК) вызывало изменения в индуцированной гибели клеток и маркерах РСК. Более того, PФЭТЦ регулировал экспрессию метадерина на посттранскрипционном уровне, что было подтверждено с использованием циклогексимида, ингибитора синтеза белка [15].
Гипоксия опухоли приводит к метастазированию и определенным иммунным реакциям, а также нарушает нормальные биологические функции. Она также влияет на потребление глюкозы, снижает окислительное фосфорилирование и ингибирует десатурацию жирных кислот, регулируемую индуцируемым гипоксией фактором 1α (HIF-1α). Хотя было обнаружено, что гипоксия опухоли способствует метастазированию опухоли, роль генов, регулируемых HIF-1α, и их применение не полностью интегрированы в клиническую практику. P.-Y. Chu и др. (2020) исследовали корреляцию между экспрессией мРНК HIF-1α, метадгерина и интерлейкина (IL)-10, а также паттерны их экспрессии в прогнозировании РМЖ, используя базы данных интерактивного анализа профилирования экспрессии генов через веб-интерфейс; микрочипы тканей были окрашены на экспрессию белка метадгерина и IL-10 с использованием иммуногистохимии. Экспрессия мРНК HIF-1α, MTDH и IL-10 сильно коррелирует и тесно связана с плохим прогнозом. Экспрессия белка метадгерина и IL-10 у пациентов РМЖ обычно имеет отрицательный статус рецептора эстрогена или рецептора прогестерона, а опухоли на поздней стадии имеют более высокую экспрессию IL-10. Что касается статуса экспрессии белка метадгерина и IL-10, результаты показали, что экспрессия белка метадгерина и IL-10 у эстроген-отрицательных или прогестерон-отрицательных пациентов РМЖ имеет худший прогноз [16].
Недавно A. Tervasmäki и др. идентифицировали рецидивирующую мутацию зародышевой линии MCPH1, p.Arg304ValfsTer3, как аллель предрасположенности к РМЖ. Ген MCPH1 кодирует многофункциональный белок, участвующий в поддержании целостности генома, и он также соматически изменяется при различных типах рака, включая РМЖ. Кроме того, биаллельные мутации гена MCPH1 являются причиной микроцефалии и преждевременной конденсации хромосом на клеточном уровне. Чтобы изучить молекулярные механизмы, приводящие к предрасположенности к раку и злокачественному превращению, авторы смоделировали эффект мутации MCPH1 p.Arg304ValfsTer3, используя геномные эпителиальные клетки молочной железы MCF10A. Авторы показали, что мутировавший ген MCPH1 дерегулирует транскрипционные программы, связанные с инвазией и метастазированием, и приводит к снижению регуляции генов гистонов. Эти глобальные изменения транскрипции отражаются значительно увеличенным потенциалом миграции и инвазии клеток, а также аномальной конденсацией хромосом как до, так и после митоза. Эти результаты дают новое молекулярное представление о функциях опухолевого гена супрессора MCPH1 и устанавливают роль в регуляции транскрипционных программ, связанных со злокачественной конверсией и сборкой хромосом. Опухоли молочной железы – носители MCPH1 p.Arg304ValfsTer3 показали рецидивирующие мутации гена-супрессора опухолей TP53, которые также были значительно чрезмерно представлены в опухолях молочной железы с соматически инактивированным MCPH1 [17].
Удаляемый при РМЖ (DBC1) является регуляторным белком, участвующим в клеточном метаболизме и прогрессировании некоторых типов рака, например гепатоцеллюлярной карциномы [18]. S.A. Best и др. провели вычислительный анализ, включающий изменения числа копий и профили экспрессии генов в 1024 РМЖ, сгруппированных в четыре молекулярных подтипа: люминальный A, люминальный B, HER2 и базальный. Анализы выявили несколько генов, коррелирующих во всех подтипах, таких как KIAA1967 и MCPH1. Кроме того, было обнаружено несколько специфичных для подтипа генов, которые показали значительную корреляцию между числом копий и профилями экспрессии генов: SMARCB1, AZIN1, MTDH в просвете A, PPP2R5E, APEX1, GCN5 в просвете B, TNFAIP1, PCYT2, DIABLO в HER2 и FAM175B, SENP5, SCAF1 в базальном подтипе. Это исследование показало, что вычислительный анализ, объединяющий количество копий и экспрессию генов, может способствовать раскрытию молекулярных механизмов рака и выявлению новых биомаркеров, специфичных для данного подтипа [19].
Изменения числа копий или count number aberration (CNAs) могут способствовать прогрессированию опухоли путем изменения уровней экспрессии генов. Однако из-за адаптивных механизмов транскрипции CNA не всегда пропорционально преобразуются в измененные уровни экспрессии. Путем повторного анализа более 34 000 профилей экспрессии генов выявляют степень транскрипционной адаптации к CNA в масштабах всего генома, которые тесно связаны с различными биологическими процессами. A. Bhattacharya и др. (2020) разработали независимый от платформы метод – транскрипционную адаптацию к профилированию CNA, который извлекает транскрипционные эффекты CNA из профилей экспрессии генов, не требуя парных профилей. Применяя профилирование CNA к более чем 28 000 образцам опухолей, полученных от пациентов, авторы определили ландшафт транскрипционных эффектов CNA. Полезность этого ландшафта демонстрируется идентификацией четырех генов, которые, по прогнозам, будут участвовать в уклонении от иммунитета опухоли при транскрипционном воздействии CAN [19].
Массивные соматические мутации, обнаруженные в ходе крупных проектов по секвенированию генома рака, открывают беспрецедентные возможности в развитии молекулярной онкологии. Дисфункция посттрансляционной модификации белка играет решающую роль в онкогенезе и лекарственной реакции [20–22]. Zhao J. и др. (2019) предложили новый подход к вычислительной онкопротеомике, названный kinome-wide network module для фармакогеномики рака (KNMPX), для выявления активных мутаций, которые перестраивали сигнальные сети и дополнительно характеризовали онкогенез и реакцию на противоопухолевые препараты. В частности, они интегрировали 746 631 миссенс-мутацию в 4997 образцах опухолей по 16 основным типам/подтипам рака из Атласа генома рака в более 170 000 тщательно отобранных участков необильного фосфорилирования, охватывающих 18 610 белков. Они обнаружили 47 мутировавших белков (например, ERBB2, TP53 и CTNNB1), которые имели обогащенные миссенс-мутации в своих сайтах фосфорилирования в панраковом анализе. Кроме того, модули взаимодействия тканеспецифичной киназы с субстратом, измененные соматическими мутациями, идентифицированными KNMPx, были значительно связаны с выживаемостью пациентов. Далее они сообщили об общекиномном ландшафте фармакогеномных взаимодействий, включив сигнальные сети, связанные с соматическими мутациями, в 1 001 линиях раковых клеток с помощью KNMPx. Интересно также, что они обнаружили, что клеточные линии могут в высокой степени воспроизводить мутации сайта онкогенного фосфорилирования, выявленные в первичных опухолях, поддерживая уверенность в их связи с чувствительностью/устойчивость к ингибиторам, нацеленным на EGF, MAPK, PI3K, mTOR и сигнальные пути Wnt. Таким образом, подход KNMPX эффективен для выявления онкогенных изменений посредством перестройки сигнальных сетей, связанных с фосфорилированием, и чувствительности/резистентности к лекарственным средствам в эпоху точной онкологии [23].
Разработка новых вычислительных подходов, способных разрабатывать правильные персонализированные лекарства, является важнейшей терапевтической проблемой в исследованиях рака. Однако гетерогенность опухоли является основным препятствием для разработки отдельных лекарств для конкретного пациента или комбинаций лекарств, которые уже существуют в клиниках. В исследовании C. Cava и др. (2021) разработан вычислительный подход, который объединяет изменение числа копий, экспрессию генов и сеть взаимодействия белков из 73 образцов базального РМЖ. 2509 прогностических генов, содержащих изменение числа копий, были идентифицированы с помощью анализа выживаемости, и была создана сеть взаимодействия белок – белок, учитывающая прямые взаимодействия. Каждый пациент был описан определенной комбинацией семи измененных белков-концентраторов, которые полностью характеризуют 73 пациента с базальным РМЖ. Они предложили оптимальную комбинированную терапию для каждого пациента с учетом взаимодействия лекарств и белков [24].
Заключение
Исследования в области молекулярной онкологии рака молочной железы с каждым годом позволяют открывать новые гены, участвующие в канцерогенезе. Предлагается новое понимание опухолей с гипоксией в метаболизме и иммунных доказательствах для терапии РМЖ. Подтип Her2 характеризуется сниженным «метаболизмом аминокислот и энергии». Эта категория включает белки, участвующие в окислении аминокислот, жирных кислот, спирта и многого другого; и еще больше усиливает заметные различия между подтипами в выработке клеточной энергии. Например, окисление алкоголя алкогольдегидрогеназой и последующие реакции альдегиддегидрогеназами были ниже в опухолях Her2. Окисление жирных кислот, представленное ацил-КоА-дегидрогеназами, также было снижено. В то время как в опухолях Her2 этот путь, как правило, был ниже, на самом деле повышалась регуляция множества белков. Эти ферменты с повышенной регуляцией участвуют в различных функциях, таких как метаболизм пролина (PYCR1,2, PYCRL и PRODH), метаболизм метионина (HNMT) и триптофана (KMO). Путь «клеточного сообщества» состоит из белков цитоскелета, внеклеточного матрикса и молекул клеточной адгезии. Подобно метаболическим путям, описанным выше, в целом он был значительно снижен в подтипе Her2, но некоторые из сетевых белков были повышены. Миозины (MYH) были в целом снижены, а также семейство внеклеточных белков ламининов. Напротив, в этом подтипе было повышено содержание нескольких коллагенов и фибронектина. Эта сеть также показала более высокие уровни тромбоспондина, который может опосредовать взаимодействие клетки и матрикса. В подтипе Her2 наиболее поразительным открытием было повышение «биосинтеза и метаболизма гликанов», которое включает белки, участвующие в гликозилировании в гольджи, такие как фукозилтрансфераза, ацетилгалактозаминилтрансфераза, а также белки, которые участвуют в деградации гликанов в лизосоме, такие как гексозаминидаза (HEXA, HEXB) или маннозидаза (MAN2B2, MAN1B1, MAN2A1). Все эти изменения указывают на заметные различия в паттернах гликозилирования в подтипе Her2. Такие изменения еще не были тщательно исследованы. В целом эти результаты подчеркивают основные функциональные различия между подтипами РМЖ и раскрывают молекулярную сеть, связанную с этими функциями.
По оценкам, наследственная предрасположенность к РМЖ вызывает около 5–10 % всех случаев. Поскольку известные гены восприимчивости, такие как BRCA1 и BRCA2, объясняют лишь малую часть этого, активно ведутся поиски дополнительных предрасполагающих генов и связанных с ними биологических механизмов. Изменения числа копий могут способствовать прогрессированию опухоли путем изменения уровней экспрессии генов. Глубокое понимание функциональных последствий соматических мутаций и выявление действенных мутаций и связанных с ними лекарственных реакций в настоящее время остаются серьезными проблемами.