science-review.ru
Онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире и, следовательно, серьезной глобальной проблемой здравоохранения. Заболеваемость раком оценивается примерно в 19,3 млн новых случаев в 2020 г. с уровнем смертности примерно в 10 млн случаев [1].
Нейтрофилы считаются мощными эффекторными клетками, вызывающими врожденный защитный ответ против различных патогенов. Нейтрофилы являются наиболее распространенными циркулирующими лейкоцитами, на их долю приходится 50–70 % клеток крови. Нейтрофилы представляют собой первую линию защиты от инфекций, поэтому они быстро поступают из кровотока в место повреждения, где уничтожают патогены путем фагоцитоза, дегрануляции и высвобождения внеклеточных ловушек (NETs) [2].
С другой стороны, нейтрофилы являются существенной частью микроокружения опухоли, при этом показано, что они способны стимулировать рост опухолей. Данное противоречие имеет как теоретическое, так и существенное практическое значение, так как требует осмысления роли нейтрофилов в канцерогенезе, а также требует учитывать их роль при планировании лечения [3].
Материалы и методы исследования
Произведен поиск литературы за последние 10 лет по специальным медицинским статьям в Pubmed, Cochrane library, Medline и др. с включением ключевых слов: Neutrophils, cancer, tumor, neutrophil to lymphocyte ratio, NEtosis, tumor association, neutrophil (PMN) function, neutrophil extravasation, extracellular matrix (ECM), chemotactic gradients.
Цель исследования – оценить соотношение онкогенных и антионкогенных потенций нейтрофилов в условиях канцерогенеза, оценить роль нейтрофилов в прогнозе развития онкологических заболеваний и в эффективности их лечения.
Результаты исследования и их обсуждение
Роль нейтрофилов в развитии рака
Долгое время функциональное разнообразие нейтрофилов упускалось из виду по сравнению с другими миелоидными клетками, однако в нескольких исследованиях недавно была показана высокая гетерогенность среди них, а также их пластичность. Было показано, что, даже если активация нейтрофилов вызывает повреждение окружающих тканей, высвобождая активные формы кислорода и протеолитические ферменты, данные клетки, тем не менее, имеют решающее значение для регенерации тканей. Это связано с тем, что нейтрофилы способны продуцировать факторы роста и проангиогенные белки, которые способствуют реваскуляризации, а также индуцировать рекрутирование макрофагов, что в свою очередь поддерживает и ускоряет восстановление тканей [3].
Вследствие таких противоположных функций роль нейтрофилов в развитии рака неоднозначна. Нейтрофилы реагируют на различные медиаторы, высвобождаемые в микроокружении опухоли, что приводит к активации их либо противоопухолевых, либо проопухолевых фенотипов. Данная нейтрофильная пластичность обусловлена влиянием трансформирующего фактора роста β (TGFß), β-интерфероном (ИФН-β), ИЛ-35, а также концентрацией цитокинов и кислорода в микроокружении опухоли [4].
Нейтрофилы N1 характеризуются высокой экспрессией иммуноактивирующих хемокинов и цитокинов, включая фактор некроза опухоли α (TNF-α), который активирует специальные рецепторы, способные распознавать злокачественную клетку и блокирующие ее дальнейшее деление, а также способствующие ее некрозу [5]; молекулу межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), которая, например, в модели ксенотрансплантата меланомы способствует агрегации и удержанию Т-клеток в опухолевой нише посредством связывания с β2-интегрином LFA-1, что приводит к улучшению иммунного контроля и потенциально ограничивает развитие опухоли [6]; рецепторный белок Fas, содержащий внутриклеточный домен смерти и участвующий в запрограммированном механизме апоптоза [7]. Противоопухолевая активность нейтрофилов N1 связана с прямым уничтожением опухолевых клеток путем выработки активных форм кислорода (АФК) и оксида азота или индукцией апоптоза, связанного с активацией Fas/TRAIL. Другие механизмы включают антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и активацию функции Т-клеток [8].
В других исследованиях было показано, что нейтрофилы N2 играют проопухолевую роль с помощью нескольких механизмов. Они способствуют развитию опухоли путем выработки активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (RNS), а также стимуляции пролиферации опухолевых клеток путем секреции нейтрофильной эластазы (NE), способствующей усилению инвазии опухолей, прогрессированию метастазов [9] и секреции матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), активирующей факторы роста pro-TGF-βиpro- TNF-α. [10]. Нейтрофилы N2 работают в качестве опухолевых промоторов и экспрессируют хемокины CC и CXC, обладающие ангиогенным эффектом, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и рецептор CXCR4, которому принадлежит ключевая роль в процессах проникновения клеток опухоли сквозь межтканевые барьеры [11].
Таким образом, с одной стороны, молекулярно одним из первых механизмов, посредством которых нейтрофилы способствуют росту опухоли, является высвобождение АФК, которые, в свою очередь, вызывают повреждение ДНК, что лежит в основе развития рака, пролиферации клеток и увеличения мутационной нагрузки.
С другой стороны, нейтрофилы способствуют отделению опухолевых клеток от базальной мембраны, ингибируя начальные фазы канцерогенеза. Гипероксическое микроокружение ограничивает накопление нейтрофилов в опухолях, но инфильтрирующие опухоль нейтрофилы демонстрируют высокий противоопухолевый потенциал из-за повышенного высвобождения АФК, которые ограничивают пролиферацию опухолевых клеток и индуцируют апоптоз [12]. Возможно, что столь разнонаправленное действие АФК связано с различным количеством продуцируемых АФК нейтрофилами. С одной стороны, при низких уровнях АФК способствует выживанию раковых клеток, поскольку прогрессирование клеточного цикла, вызванное факторами роста и рецепторными тирозинкиназами (RTK), требует АФК для активации [13]. С другой стороны, высокий уровень АФК может подавлять рост опухоли за счет устойчивой активации ингибитора клеточного цикла и индукции гибели клеток [14].
Влияние нейтрофилов на метастазирование
Распространение опухолевых клеток и образование метастатических очагов во вторичных органах при опухолевой прогрессии представляет собой многоэтапный процесс, включающий ряд событий, относящихся к судьбе опухолевых клеток: процессы инвазии в окружающие здоровые ткани, инфильтрации кровеносных сосудов, выживания, экстравазации во вторичные очаги, где формируются микрометастазы, которые в итоге пролиферируют в клинически выявляемые метастатические очаги [15].
В последние годы было проведено множество исследований, в которых было доказано, что нейтрофилы могут высвобождать свободную ДНК в периферическую циркуляцию в форме NETs. Нити ДНК, включающие гистоны и белки гранул нейтрофильных клеток, являются основным компонентом так называемых сеток. Сетки, обладающие антибактериальными свойствами, являются результатом нескольких внутриклеточных изменений. В процессе, называемом нетоз (NETosis), ядро нейтрофила теряет свою форму, происходит деконденсация его хроматина, мембраны, окружающие ядро и гранулы, растворяются, и белки гранул соединяются с нитями ДНК. Таким образом, подготовленная ловушка (NETs) высвобождается за пределы клетки и является одной из форм иммунологического ответа нейтрофилов.
Однако NETs могут способствовать прогрессированию опухолевого роста. Установлено, что NETs играют ключевую регуляторную роль в микроокружении опухоли, такую, как развитие отдаленных метастазов за счет секреции протеаз, т.е. матриксных металлопротеиназ, и образования провоспалительных цитокинов. Кроме того, ловушки напрямую усиливают агрессивность опухоли, усиливая миграцию опухолевых клеток и их способность к инвазии. Также есть данные, которые свидетельствуют о том, что благодаря индукции высокомобильной группы box 1 NETs индуцируют переход эпителия в мезенхиму в опухолевой ткани и тем самым способствуют усилению инвазивности опухолевых клеток [16].
Таким образом, роль формирования NETs нейтрофилами следует признать противоречивой, так как, с одной стороны, высвобождение внеклеточных ловушек имеет защитное значение, а с другой, способствует развитию канцерогенеза.
Нейтрофилы как маркеры онкологических заболеваний
Полученная в последние годы информация о функциях нейтрофилов формирует новое понимание их роли в физиологии и патологии. Одним из практических выходов из этого являются предложения использовать полученные сведения для диагностики патологических процессов. Это может улучшить качество диагностики и повлиять на эффективность проводимой терапии.
Биомаркеры NETs
В частности, была показана клиническая полезность определения биомаркеров NETs в слюне, в сыворотке крови и опухолевой ткани в качестве потенциальной прогностической и терапевтической мишени у пациентов с плоскоклеточным раком полости рта: в супернатантах, полученных после инкубации нейтрофилов у пациентов, страдающих данным заболеванием, было установлено увеличение концентрации циркулирующих фрагментов свободной ДНК, которые образуют каркас NETs [17].
Соотношение: нейтрофилы к лимфоцитам
Известно, что соотношение нейтрофилов и лимфоцитов играет важную роль как маркер определения злокачественности новообразования.
Соотношение нейтрофилов и лимфоцитов (NLR) считалось показателем системного воспаления во многих современных клинических исследованиях, когда у пациентов не было явной инфекции. Между тем онкогенез тесно связан с воспалением, поскольку показано, что воспалительные клетки способствуют пролиферации раковых клеток, ангиогенезу и инвазии опухоли [18].
На данный момент существует множество исследований, показывающих неблагоприятный прогноз у пациентов, имеющих высокие уровни этого соотношения. Так, предполагается, что высокое значение отношения нейтрофилов к лимфоцитам крови, связано с худшими исходами онкологической выживаемости, например, при раке гортани [19], раке желудка [20], колоректальном раке II стадии [21]. А результаты определения NLR у пациентов с мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря после радикальной цистэктомии, показали, что увеличение NLR в послеоперационный период является потенциальным маркером раннего выявления рецидива [22].
Нейтрофилы как мишень для терапевтических вмешательств
Борьба с ранним ангиогенезом опухоли
Опухолевой ангиогенез является одним из наиболее важных этапов прогрессирования рака. Как упоминалось выше, нейтрофилы играют большую роль в опухолевом ангиогенезе, поэтому влияние на проангиогенные способности данных иммунных клеток является перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний. Метастазирование рака также представляет собой серьезную проблему для эффективной терапии рака. Было показано, что проангиогенные нейтрофилы в значительной степени способствуют отслоению опухолевых клеток и началу их распространения по кровеносной системе, что также делает данные клетки перспективной мишенью в борьбе с прогрессированием рака.
Установлено, что нейтрофилы поддерживают ангиогенез опухоли за счет высвобождения многочисленных проангиогенных факторов, таких как VEGF, FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2 – фактор роста фибробластов 2), онкостатин M, ИЛ-17, MMP-9, Bv8 (белок, нейтрофильный медиатор ангиогенеза опухоли), алармины S100A8/9, STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3 – сигнальный белок и активатор транскрипции из семейства белков STAT, который у человека кодируется геном STAT3. STAT3 является одним из белков-посредников, обеспечивающих ответ клетки на сигналы, поступающие через рецепторы интерлейкинов и факторов роста) и NETs. Выявление других возможных проангиогенных факторов могло бы усилить успешность терапии рака [23].
Самые первые исследования антиангиогенной терапии были сосредоточены на блокировании передачи сигналов VEGF/VEGFR с помощью специфических моноклональных антител. В настоящее время бевацизумаб и рамуцирумаб являются основными препаратами для подавления ангиогенеза при раке. Однако выяснилось, что эти препараты оказались малоэффективными в клинических испытаниях из-за сформировавшейся резистентности опухоли к ним. Влияние нейтрофилов на резистентность к анти-VEGF-терапии было продемонстрировано в исследовании K. Jung et. al. (2017) [22], которые показали, что повышенная нейтрофильная инфильтрация после введения анти-VEGF-2 способствует ангиогенезу опухоли и снижает эффективность терапии. В этом исследовании было показано, что Ly6C10 моноциты, присутствующие в опухоли, облегчают рекрутирование Ly6G+ нейтрофилов после анти-VEGFR2 терапии посредством высвобождения CXCL5 (C-X-C motif chemokine 5). Интересно, что сочетание лечения, направленного против нейтрофилов, с антиангиогенной терапией путем введения анти-Ly6G-антитела, ограничивает ангиогенез и поддерживает эффективность терапии против VEGFR2 [24].
Та же исследовательская группа продемонстрировала в другом исследовании, что антиангиогенное лечение увеличивает экспрессию CXCL12 в опухолях и приводит к рекрутированию CXCR4+ проангиогенных нейтрофилов. Блокада CXCR4 с помощью AMD3100 (плериксафор, является низкомолекулярным ингибитором CXCR4) ингибировала Ly6G+ инфильтрацию нейтрофилов в опухоль, что приводило к повышению эффективности анти-VEGF-терапии [25].
Одной из причин инфильтрации нейтрофилами метастазов у пациентов с колоректальным раком при анти-VEGF-терапии предполагается развитие в них активного воспалительного процесса. С помощью иммуногистохимических методов окрашивания было продемонстрировано наличие CD177+ нейтрофилов в образцах метастаз колоректального рака. Комбинация традиционной антиангиогенной терапии (бевацизумаб) и нового соединения анти-VEGF/анти-Ang2 (BI-880) уменьшала инфильтрацию нейтрофилов и эффективно уменьшала ангиогенез, рост опухоли и гипоксию ткани. Было показано, что мыши с VEGF-резистентными колоректальными опухолями имеют повышенный уровень G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) в плазме, что приводит к сильной мобилизации нейтрофилов, их опухолевой инфильтрации и индукции экспрессии Bv8, что поддерживает опухолевый ангиогенез. Было также показано, что терапия против VEGF в сочетании с антителами против G-CSF или против Bv8 эффективно подавляет рост опухоли [23].
Запуск нейтрофил-опосредованного противоракового иммунитета
Известно, что галектин-9 (Gal-9) обладает прямой цитотоксической и опухолеселективной активностью по отношению к линиям раковых клеток различного происхождения. В исследовании Ustyanovska Avtenyuk N. et. al. [26] было показано, что Gal-9 вызывает выраженные изменения мембран в раковых клетках. В частности, фосфатидилсерин (PS) быстро выводился наружу, а антифагоцитарный регулятор CD47 подавлялся в течение нескольких минут. В соответствии с этим обработка смешанных культур нейтрофилов/опухолевых клеток Gal-9 запускала трогоцитоз, усиливала антителозависимый клеточный фагоцитоз раковых клеток и снижала адгезию раковых клеток в смешанных культурах лейкоцитов и раковых клеток. Помимо этого, при смешивании лейкоцитов с предварительно прикрепленными раковыми клетками была обнаружена заметная цитотоксичность, которая исчезала при истощении пула нейтрофилов. В совокупности, лечение Gal-9 активировало опосредованный нейтрофилами противораковый иммунитет, что приводило к элиминации эпителиальных раковых клеток [26]. Эти исследования позволяют говорить о том, что использование Gal-9 является перспективным направлением в терапии рака.
Выводы
1. Нейтрофилы играют двоякую роль в патогенезе развития опухолей. С одной стороны, они способствуют развитию рака за счет усиления ангиогенеза путем экспрессии хемокинов СС и CXC, VEGF. А инвазия и метастазирование опухоли осуществляется с помощью рецептора CXCR4, NE, MMP9, NETs. С другой стороны, нейтрофилы тормозят прогрессирование заболевания за счет экспрессии TNF-α, ICAM-1, механизма ADCC. Данная противоречивость в эффектах нейтрофилов создает проблемы в оценке их истинной роли в онкогенезе. И формирует вопросы, на которые пока что нет определенных ответов. В частности, непонятно, от чего зависит изменение соотношения про- и антионкогенных потенций нейтрофилов, с которым может быть связано развитие опухоли.
2. Нейтрофилы могут быть использованы в качестве маркера онкологического заболевания. Уже известны по меньшей мере два прогностически значимых параметра, позволяющих судить о злокачественности опухоли – это соотношение нейтрофилов и лимфоцитов и наличие нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, сыворотке крови и опухолевой ткани.
3. Опосредованный нейтрофилами опухолевый ангиогенез и метастазирование препятствуют достижению успеха в лечении многих видов рака. Тем не менее воздействие как на ангиогенез, так и на функции нейтрофилов при раке демонстрируют большой потенциал и являются перспективными направлениями в иммунотерапии рака.