science-review.ru
Травмы являются одной из ведущих причин гибели от неестественных причин. Существенную роль в патологии травм играют повреждения кожи и органов опорно-двигательного аппарата, поэтому ученые ищут различные средства восстановления структурной и функциональной целостности их тканей. Одно из перспективных решений данной проблемы – создание тканеинженерных каркасов для регенерации костной и хрящевой ткани, а также биоразлагаемых раневых покрытий. Для создания таких продуктов зачастую используется хитозан из-за его антибактериальных и физико-химических свойств. Хитозан заинтересовал ученых еще с XIX в. Хитин был открыт в 1811 г. H. Braconnot и A. Odier, а хитозан – в 1959 г., спустя 48 лет, С. Rouget. Биологическая активность хитозана недостаточна для некоторых случаев биомедицинского применения, поэтому в настоящее время изучаются композитные материалы на основе хитозана и биополимеров, когда к хитозановой основе добавляются различные добавки. Одной из таких добавок является коллаген или его производные, в частности желатин. Коллаген – это белок, который составляет основу соединительной ткани и придает композитным материалам прочность и эластичность. Также активно изучаются материалы на основе хитозана с фибрином и альбумином, которые повышают биосовместимость композитов.
Цель работы – описать состояние исследований влияния функционализации коллагеном и его производными (желатином), а также фибрином и альбумином на свойства хитозановых каркасов и раневых покрытий.
Раневые покрытия на основе композитов хитозана с коллагеном и желатином
Одним из самых распространенных биополимеров, вводимых в продукты на основе хитозана, является коллаген. Достоинства коллагена, такие как биосовместимость, доступность и простота получения, обуславливают значительную широту его применения.
Хитозан-коллагеновые продукты могут быть использованы как каркасы для тканевой инженерии кожи. Так, известны повязки, а также пористые губки и мембраны, полученные лиофильным высушиванием [1–3]. Кроме того, рядом авторов путем электроспиннинга были получены волокнистые скаффолды [4–6]. Подобные продукты могут быть функционализированы различными соединениями для достижения противомикробного или ранозаживляющего эффекта [2, 4, 6]. Хитозан-коллагеновые продукты повышают адгезию и пролиферацию первичных и перевиваемых линий фибробластов. Также было продемонстрировано повышение секреции цитокинов фибробластами на композитных хитозан-коллагеновых губках [3]. Ряд авторов также проводил исследования хитозан-коллагеновых каркасов ex vivo и in vivo, в ходе которых была выявлена высокая степень неоваскуляризации формирующихся на каркасе тканей, а также ускорение эпителизации раны [1, 4, 5]. Помимо повышенной эпителизации, в моделях ран было также продемонстрировано увеличение скорости пролиферации и повышение клеточной адгезии кератиноцитов in vitro [2, 7, 8].
Также многие коллективы исследуют желатин-хитозановые раневые покрытия, поскольку желатин является широкодоступной и дешевой в получении частично гидролизованной формой коллагена [9, 10].
В работе Алехина и Гаенко было продемонстрировано, что обработка культурального пластика хитозаном и желатин-хитозановым композитом повышала адгезию эмбриональных фибробластов мыши 3T3-J2 по сравнению с контролем. При этом в первые сутки наблюдалась тенденция к более быстрой адгезии клеток на поверхности, обработанной желатин-хитозановой смесью [11]. Использование смеси желатина и хитозана для обработки децеллюляризованных клеточных матриксов также повышает скорость адгезии фибробластов [12]. Добавление желатина вместо коллагена увеличивает коэффициент набухания и скорость биодеградации, но уменьшает проницаемость для воздуха и для паров воды, что является важной характеристикой раневого покрытия. Исследования Mousavi и соавторов демонстрируют увеличение скорости пролиферации фибробластов как при добавлении коллагена, так и при добавлении желатина к хитозановому гелю. При этом использование желатина повышало пролиферацию в большей степени, нежели добавление коллагена [13]. Ferreira и соавт. методом электроспиннинга получали желатин-хитозановые волокна с добавлением экстракта Undaria pinnatifida, что приводило к усилению антимикробной активности, а также гидрофильности сеток, изготовленных из волокон. Данные сетки обеспечивали условия, достаточные для адгезии и пролиферации фибробластов человека, определенной по метаболической активности в реазуриновой пробе. При этом добавление экстракта U. pinnatifida не приводило к снижению пролиферации фибробластов, однако была установлена обратная зависимость между пролиферацией клеток и плотностью сетки [14].
Матриксы для регенерации костной ткани на основе композитов хитозана с коллагеном и желатином
Хитозан-коллагеновые матриксы можно использовать также для культивирования мезенхимальных стромальных клеток (MSC). MSC, в свою очередь, используются в регенеративной медицине для инженерии костной ткани. Так, известны мембраны, губки, нановолокна и микрочастицы на основе хитозан-коллагена с добавлением дополнительных компонентов. К таким добавкам относятся обогащенная тромбоцитами плазма (тромбоцитарный концентрат, PRP), диоксид титана, частицы кремния. Подобные материалы повышали жизнеспособность MSC и стимулировали остеогенную дифференциацию, что было показано путем измерения активности щелочной фосфатазы, а также анализа экспрессии генов RUNX-2, COL-I, OC и VEGF методом qPCR [15]. Кроме того, была продемонстрирована повышенная адгезия MSC к мембране из хитозан-коллагена с добавлением гидроксиапатита [16].
Кроме того, были разработаны плотные гибридные и фотополимеризуемые гидрогели, на основе коллагена и хитозана. Коллаген-хитозановые гели улучшают адгезию, миграцию, пролиферацию и остеогенную дифференцировку стромальных клеток костного мозга мышей, а также жизнеспособность клеток MC3T3-E1 [17]. Аналогичные данные были также получены для лиофильно высушенных коллаген-хитозановых губок с добавлением наногидроксиапатита и гиалуроновой кислоты [18]. Каркасы на основе коллаген-хитозана и биоактивного стекла значительно повышают пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC). Также они могут стимулировать экспрессию транскрипционного фактора Runx2, активируемого киназой Erk1/2. Этот сигнальный путь является одним из главных путей в дифференцировке остеобластов [19]. Кроме того, было установлено, что композитные скаффолды из хитозана-коллагена с добавлением фиброина шелка являются биологически совместимыми с остеобластоподобными клетками MG-63 [20].
Вместо коллагена в тканевой инженерии кости также используется желатин [21]. Желатин и коллаген разделяют многие биологические свойства, и различия в эффективности их применения являлись и являются направлением многочисленных исследований [22]. Одним из недостатков желатина является его вариабельная скорость биодеградации, зависящая от способа получения, а также повышенная по сравнению с коллагеном водорастворимость в условиях организма. Для решения этой проблемы были предложены различные способы дальнейшей модификации смесей хитозана и желатина, такие как перекрестная сшивка молекул этих полимеров [23]. Так, известны способы сшивания хитозан-желатиновых каркасов с использованием глутарового альдегида, генипина и глиоксаля. Полученные продукты обладают улучшенными механическими свойствами и не проявляют цитотоксичности по отношению к клеткам MG-63 [20]. Georgopoulou и соавт. сравнивали сшивание молекул глутаровым альдегидом и генипином. При сшивании глутаровым альдегидом выживаемость и пролиферация, а также адгезия и инфильтрация преостеобластов MC3T3-E1 были выше, чем при сшивании генипином [24]. Альтернативным способом поперечной сшивки молекул желатина является обработка ультрафиолетовым излучением [25].
Chi и соавт. указывают на недостаточно высокую эффективность желатин-хитозановых гелей и предлагают добавление PRF (тромбоцитарный фибрин). В проведенном ими исследовании лиофильно высушенные желатин-хитозановые каркасы лишь незначительно увеличивали пролиферацию и ускоряли адгезию мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. При этом добавление PRF вызывало статистически достоверное повышение данных показателей [22].
Матриксы для регенерации хрящевой ткани на основе композитов хитозана с коллагеном и желатином
Одним из применений коллаген-хитозановых продуктов является регенерация хрящевой ткани. Так, Korpayev и соавт. предлагают создание каркаса, который моделирует нижний костный слой, промежуточный кальцифицированный хрящевой слой и верхний хрящевой слой. При этом костный слой был изготовлен путем лиофилизации из хитозана и коллагена I типа с добавлением наногидроксиапатита. Промежуточный и верхний хрящевые слои представляли собой гели, полученные из хитозана и коллагена II типа, при этом в промежуточном слое также содержался наногидроксиапатит. В полученном продукте преостеобласты MC3T3-E1 в слое кости и клетки ATDC5, находящиеся в остальных слоях, показали высокую жизнеспособность в MTT-тесте и по содержанию ДНК. Кроме того, анализ экспрессии генов путем RT-qPCR показал, что в клетках MC3T3-E1 возросла экспрессия щелочной фосфатазы и собственного коллагена I типа, а в клетках ATDC5 – собственного коллагена II типа [26].
Многие авторы предлагают создание гелей и пористых скаффолдов для регенерации хрящевой ткани из коллагена и хитозана. Известны гели, функционализированные наночастицами биоактивного стекла, TGF-β1, а также коллагеном II типа и хондроитинсульфатом [27–29]. В первом случае армирование наночастицами увеличивало жесткость и не вызывало токсической реакции. Во втором случае добавление TGF-β1 способствовало клеточной агрегации и хондрогенной дифференцировке инкапсулированных клеток. Добавление хондроитинсульфата и коллагена II типа в хитозановый матрикс значительно усиливало клеточную пролиферацию и синтез гликозаминогликанов. Также были получены биоразлагаемые пористые скаффолды из сшитого генипином коллагена и хитозана. При посеве на данные каркасы хондроцитов кролика было достигнуто увеличение пролиферации клеток в MTT-тесте [30].
Для регенерации хрящевой ткани возможно использовать не только коллаген-хитозановые, но и желатин-хитозановые композиты [31]. Так Shu Wen Whu и соавторы предлагают создание каркаса из желатин-хитозана, сшитого карбодиимидом. Исследование показало, что полученный продукт, засеянный хондроцитами, способствовал регенерации дефекта суставного хряща кроликов [32].
Матриксы для регенерации костной ткани на основе композитов хитозана с фибрином и альбумином
Фибрин активно применяется в регенеративной медицине. Поэтому он нашел свое применение и как добавка к хитозану. Хитозан-фибриновые изделия применяются для создания раневых покрытий [33]. Хитозан без добавления фибрина проявляет достаточную антибактериальную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а добавление фибрина улучшает биосовместимость и дополнительно увеличивает антибактериальный эффект [34].
Еще одним направлением применения хитозан-фибриновых биокомпозитов является регенерация костной ткани [35, 36]. Так, Zhang и соавт. предлагают создание трехслойного композитного каркаса. Первый слой изготовлен из гидрогеля на основе хитозана, поли-γ-глутаминовой кислоты и гидроксиапатита путем лиофилизации для обеспечения остеокондуктивности. Второй слой состоит из богатого тромбоцитами фибрина и является источником факторов роста, способствующих остеоиндукции. Третий слой включает в себя нановолоконную пленку, изготовленную из поликапролактона и желатина методом электропрядения, и действует как барьер, предотвращающий миграцию в каркас клеток из окружающих соединительных тканей. Полученный композит вводился в дефект кости поэтапно. Данные каркасы стимулировали пролиферацию клеток 3T3 и активность щелочной фосфатазы в клетках пульпы зуба человека (HDPSC) [37].
Несмотря на то, что в тканевой инженерии кости активно используются отдельно биокомпозитные матриксы на основе хитозана с фибрином, а также отдельно – матриксы на основе хитозана с коллагеном или желатином, существует крайне мало исследований, посвященных применению матриксов, включающих одновременно хитозан, фибрин и коллаген/желатин [38]. Учитывая успехи, достигнутые Ansarizadeh и соавт., изучение композиций с подобным составом может оказаться ключом к созданию биологически активных матриксов с регулируемыми физическими свойствами [39].
Хитозан-фибриновые биокомпозиты нашли широкое применение в терапии патологий опорно-двигательного аппарат, включая восстановление хрящевой ткани. Следует, однако, отметить малое количество исследований, посвященных тематике восстановления хряща.
Помимо этого, хитозан-фибриновые биокомпозиты используются в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [40]. Так, Sarkar и соавт. указывают, что гидрогель из хитозана показывает лучший кровоостанавливающий эффект, нежели гель фибрина богатого тромбоцитами, однако фибриновый гель обладает преимуществом при заживлении ран [41]. Ducret и соавт. утверждают, что фибриновый гель и хитозан-фибриновый гель обладают одинаково низкой токсичностью в отношении стромальных клеток пульпы зуба (DP-MSC). При этом хитозан-фибриновый гель обладает более сильным антибактериальным действием [42]. Также Renard и соавт. подтверждают, что жизнеспособность популяции клеток пульпы зуба в фибриновом геле аналогична жизнеспособности в хитозан-фибриновом геле [43]. Приведенные данные указывают на целесообразность создания композитов из хитозана и фибрина, объединяя положительные характеристики данных веществ.
Альбумин является самым распространенным белком в плазме крови и обеспечивает высокую биосовместимость биокомпозитных материалов. Также химическая структура и конформация альбумина позволяет ему связываться со многими лекарственными веществами, поэтому он является отличным носителем лекарственных средств. Из-за своих свойств альбумин активно применяется совместно с хитозаном в регенеративной медицине [44].
Также хитозан совместно с альбумином применяется для регенерации костной ткани [45]. Так, Lin и соавт. предлагают создание каркаса из нановолокна, содержащего наночастицы бычьего сывороточного альбумина, стабилизированного хитозаном, для доставки абалопаратида и аспирина. Полученный каркас продемонстрировал высокую пролиферацию и скорость адгезии клеток MC3T3-E1. Также каркас способствовал дифференцировке остеобластов. Все это указывает на то, что такие каркасы могут использоваться для регенерации костной ткани [46].
Заключение
Исследователи активно разрабатывают полимерные композиции, которые могли бы улучшать свойства хитозана. Так, ведется множество исследований в области добавления в хитозановые каркасы коллагена или желатина. Добавление коллагена улучшает пролиферацию и адгезию фибробластов, ускоряет эпителизацию ран и пролиферацию кератиноцитов. В свою очередь, добавление желатина повышает адгезию эмбриональных фибробластов мыши 3T3-J2, также увеличивает пролиферацию хондроцитов. Добавление желатина увеличивает коэффициент набухания и скорость биодеградации, но уменьшается проницаемость для воздуха и для паров воды. Такие свойства желатина делают его актуальным при добавлении его в хитозановые скаффолды для регенерации хрящевой и костной ткани. При этом для раневых покрытий имеет преимущество добавление коллагена, так как желатин ухудшает проницаемость материала, что оказывает негативное влияние на заживление раны.
Биодеградируемые матриксы на основе хитозана с добавлением различных биополимеров являются перспективным объектом исследований в области регенеративной медицины, для регенерации костной и хрящевой ткани.
Работа выполнена в рамках гранта Губернатора Алтайского края в форме субсидий для разработки качественно новых технологий, создания инновационных продуктов и услуг в сферах переработки и производства пищевых продуктов, фармацевтического производства и биотехнологий в соответствии с п. 4 ст. 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации по теме «Разработка технологии получения биологически активного культурального клеточного матрикса» (соглашение № 5 от 12 апреля 2022 года).
Партнер проекта – ООО «Диаэм».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.