Scientific journal

Научное обозрение. Медицинские науки

ISSN 2500-0780

ПИ №ФС77-57452

Макулярный отек в результате нарушения проницаемости гематоретинального барьера достаточно часто является причиной слабовидения и потери зрения у лиц преимущественно трудоспособного возраста при такой патологии сетчатки как диабетическая ретинопатия, влажная форма возрастной макулярной дегенерации и окклюзия вен сетчатки.

В нарушении гематоретинального барьера при каждой из данных патологий важную роль играет васкулоэндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor – VEGF) [21; 23; 45; 56; 65]. Современный уровень развития технологий позволяет на сегодняшний день проводить изучение молекулярно-генетических основ формирования патологии и идентифицировать ключевые регуляторные механизмы, участвующие в наступлении эффектов от проводимого лечения. Изучение молекулярных механизмов влияния VEGF на сетчатку позволит получить дополнительное представление не только о механизмах развития патологии, связанной с этим фактором, но и механизмах проведения лечения (анти VEGF – терапия, лазеркоагуляция) и повышения его эффективности, поможет идентифицировать гены для разработки будущих терапевтических стратегий.

Цель – исследовать изменения экспрессии генов в сетчатке при интравитреальном введении VEGF в эксперименте.

Материалы и методы исследования

Работу проводили на 4–5 недельных самцах мышей линии C57BL/6J.

Результаты исследования генотипа мыши свидетельствуют, что 80 % генов этого животного и человека идентичны и 99 % генов очень похожи, длина генетического кода мыши меньше, чем человека всего лишь на 14 % [16]. В связи с этим лабораторные мыши являются основной моделью для проведения биомедицинских исследований. При проведении исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико – биологических исследований с использованием животных». Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 1996).

Под общим наркозом (внутрибрюшинная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) с помощью шприца Hamilton было произведено интравитреальное введение рекомбинантного VEGF165 (R & D Systems) 50 нг/мл в 2 мкл фосфатно-солевого буферного раствора PBS (6 глаз), в контрольные глаза вводили PBS (6 глаз). Установлено, что через 24 часа после интравитреального введения 50 нг/мл VEGF животным сосудистая проницаемость увеличивается более, чем в 3 раза [41; 53; 62; 76].

Через сутки после введения VEGF выделенные образцы тканей (нейроэпителий, пигментный эпителий) были переданы для транскрипционного анализа в ЗАО «Геноаналитика» (Москва).

Суммарную РНК из выделенных образцов тканей экстрагировали с помощью реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Количество полученной общей РНК оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop (NanoDrop Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. Качество РНК проверяли с помощью чипа Agilent Total RNA Nano 6000 (Agilent Technologies, США). По 400 нг общей РНК каждого образца амплифицировали с помощью Illumina® TotalPrep ™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированную РНК гибридизовали с MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChips (Illumina) в соответствии с протоколом Illumina. Анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения GenomeStudio (Illumina, США), модуля экспрессии генов. Для интерпретации результатов транскрипционного анализа использовали транскрипты с параметром Detection_Pval < 0,01. Результаты считались значимыми при p <0,01.

Результаты исследования и их обсуждение

Регуляция экспрессии генов мембранных белков плотного контакта

Выявлено снижение экспрессии генов мембранных белков плотного контакта Ocln и Cldn –1, –2, –3, –5, –10, – 11 и 19, которые экспрессируются в эндотелии сосудов сетчатки и пигментном эпителии и обеспечивают их барьерные функции [33; 42].

В предыдущих экспериментальных работах было установлено, что в эндотелии сосудов сетчатки снижается экспрессия окклюдина и клаудинов -1 и -3 при использовании VEGF и при экспериментальном аутоиммуном ретините [18; 19; 75]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии, наоборот, было выявлено, что экспрессия клаудинов -1, -2 и -5 увеличивается и полученный результат авторы связывают с формированием неоваскуляризации [39]. На культуре фетальных клеток пигментного эпителия было установлено, что VEGF на экспрессию Cldn -3,- 10 и 19 существенно не влияет [44]. При культивировании клеток пигментного эпителия в условиях высокой концентрации глюкозы и гипоксии снижается экспрессия окклюдина и клаудина-1 [70]. Полученные нами данные могут свидетельствовать о снижении экспрессии генов мембранных белков плотного контакта, как в эндотелии сосудов сетчатки, так и в пигментном эпителии.

Снизилась экспрессия гена Ppap2b (Lpp3), который относится к мембранным гликопротеинам и отвечает за межклеточную адгезию эндотелиальных клеток. Установлено, что при инактивации LPP3 в эндотелии сосудов сосудистая проницаемость увеличивается в 2 раза [43].

Снизилась экспрессия генов Ndst1, кодирующего гепарансульфат и Hs3st3a1, отвечающего за биосинтез гепарансульфата – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки.

В 8 раз увеличилась экспрессия гранулярного мембранного белка – гликопротеина 2 (Gp2), который активирует эндотелиальные клетки и снижает функции эндотелиального барьера.

Регуляция экспрессии генов молекул межклеточной адгезии

Увеличилась экспрессия молекул межклеточной адгезии Icam-1 и 2 в 2,1 и 5,2 раза, Vcam-1 в 3,2 раза, CD44 в 6 раз и хемокина – Cx3cl1 в 3,2 раза, что свидетельствует об усилении процессов межклеточных взаимодействий и клеточной адгезии. Роль молекулы CX3C, принадлежащей к подсемейству хемокинов в формировании сосудистой патологии сетчатки меньше всего изучена, в связи с этим приводим данные только по данной молекуле. Установлено, что CX3CL1 стимулирует неоангиогенез у мышей с кислород-индуцированной ретинопатией, уровень его содержания увеличивается у пациентов в стекловидном теле при пролиферативной диабетической ретинопатии [78], у мышей с экспериментальным диабетом увеличивается уровень его экспрессии в сетчатке [54].

Экспрессия гена St3gal6, который играет ключевую роль в синтезе сиалил-лиганда клеточной адгезии E – селектина, выполняющего важную роль в инициации связывания лейкоцитов с эндотелием снизилась.

Регуляция неоангиогенеза

Увеличилась экспрессия генов Rhbdf1 в 1,5 раза и Psen2 – в 325 раз. Rhbdf1 принадлежит к семейству сериновых протеиназ (ромбоидов), расщепляющих белки, аналогичные эпидермальному фактору роста и в связи с этим обладает антиангиогенными свойствами. Psen2 – пресенилин-2 относится к семейству аспартатных протеиназ, расщепляющих внутримембранные рецепторные белки 1 типа и тоже обладает антиангиогенными свойствами, участвуя в реализации эффектов Notch сигнального пути, блокирующего ангиогенез. Установлено, что при повышении активности Notch сигнального пути формирование лазер-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации блокируется и, наоборот, при его ингибировании активируется [7]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии установлено, что в сетчатке увеличивается уровень экспрессии Psen2 [38] и Rhbdf1 [29].

Увеличилась экспрессия Tsp1 в 1,2 раза. Тромбоспондин-1 – белок внеклеточного матрикса, ингибирует эндотелиальную клеточную пролиферацию, миграцию и ангиогенез. На модели кислород-индуцированной ретинопатии было установлено, что в период активного формирования неоваскуляризации в эндотелии ретинальных сосудов экспрессия TSP-1 увеличивается; при дополнительной VEGF стимуляции наблюдается сначала снижение его экспрессии, затем наоборот, увеличение в 3 раза по принципу отрицательной обратной связи [64].

Повысилась экспрессия гена Igfbp4 – ИФР – связывающего белка, типа 4 в 1,24 раза. Igfbp4, образует комплекс с инсулиноподобным фактором роста 1 и не позволяет ему связаться с «родными» рецепторами на клетках-мишенях, блокируя тем самым его эффект – стимулировать неоангиогенез. На экспериментальной модели кислород-индуцированной ретинопатии различными авторами было выявлено увеличение экспрессии в сетчатке различных типов ИФР – связующих белков. Одни авторы выявили увеличение экспрессии Igfbp2, Igfbp4 и Igfbp5 на фоне низкой экспрессии Igfbp3 и Igfbp6 [71], другие – увеличение экспрессии Igfbp3 более чем в 5 раз в областях формирования неоваскуляризации [35]. У пациентов с непролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией в стекловидном теле выявлено увеличение концентрации Igfbp2 и Igfbp3 в 1,5 и 13 раз, соответственно [40; 46; 60].

Снизилась экспрессия гена Irs2, кодирующего субстрат инсулинового рецептора 2 и участвующего в реализации физиологических функций инсулина и факторов роста [74].

Снизилась экспрессия Egr1, участвующего в передаче сигналов VEGF-A/VEGFR2 и регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, при его блокаде, с использованием NAB2, VEGF-индуцированная экспрессия генов в эндотелиальных клетках снижается и ангиогенез ингибируется [37; 52].

Увеличилась экспрессия уридин-фосфорилазы 1 (Upp1) в 2,6 раза. Уридин-фосфорилаза входит в состав класса пиримидиновых нуклеозидфосфорилаз, катализирует реакцию расщепления гликозидной связи в уридине и обладает выраженными проангиогенными свойствами. Установлено, что в результате блокады уридин – фосфорилазы блокируется лазериндуцированная хориоидальная неоваскуляризация [77].

Регуляция структурных клеточных функций

Повысилась экспрессия 7 генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17 – в 4,8, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14 и Krt 6b, соответственно, в 3,0 -2,7– 2,5– 2,3– 2,2 и 1,5 раза). Промежуточные филаменты играют важную роль в поддержании структурной целостности внутренних слоев сетчатки, особенно клеток Мюллера. При аргон-лазерной коагуляции сетчатки в ганглиозном слое и слое нервных волокон было выявлено повышение уровня экспрессии Krt 1–12 [13]. В сетчатке крыс OXYS (преждевременно стареющие крысы) в возрасте 3 месяцев экспрессия Krt 1–12, наоборот снижается, что с точки зрения автора свидетельствует о нарушении взаимодействий между клетками и внеклеточным матриксом [4].

В 3,1 раза повысился уровень экспрессии муцина 1 (Muc1) – трансмембранного гликопротеина, входящего в состав волокон клеток Мюллера, формирующих наружную и внутреннюю пограничные мембраны и выполняющего функции клеточного протектора [67].

Увеличилась экспрессия гена ядерной ламины (фибриллярный белок) (Lmna), также обеспечивающего структурную функцию.

Экспрессия кальпаина 1 (Capns1) увеличилась в 1,75 раза, установлена его связь с нейродегенеративными процессами и пигментным ретинитом. Кальпаины – Са2+--зависимые цистеиновые протеиназы, осуществляют деградацию белков, являющихся компонентами цитоскелета [4]. Содержатся в нервной ткани в двух формах – растворимой и мембраносвязанной, которая преимущественно ассоциирована с миелином и обнаруживается в синаптических мембранах, расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин и миофибриллярные белки.

Экспрессия белков – кристаллинов – Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf и Сryge, относящихся к группе структурных генов. Функция кристаллинов заключается в защите белков от неправильного сворачивания и аггрегации, т.е. они являются шаперонами. На экспериментальных моделях глаукомы было выявлено наличие снижения экспрессии белков-кристаллинов в сетчатке [8; 47; 61], в сетчатке крыс OXYS экспрессия кристаллинов Сrygb, Crygs, Cryab, Cryba2 и Crygd снижается в 10 раз [4]. На моделях животных при лазерной коагуляции сетчатки, повреждении зрительного нерва и стрептозотоциновом диабете выявлено, наоборот повышение экспрессии кристаллинов [13; 28; 51; 72]. Xi J. с соавт. [73] и Templeton J.P. с соавт. [66] считают, что интерпретировать различия в экспрессии кристаллина в сетчатке следует с осторожностью, так как они значительно варьируются и зависят от инициирующего стимула.

Регуляция процессов клеточной пролиферации транскрипции (построение РНК по комплементарной ДНК) и дифференциации

В обеспечении скоординированного баланса между процессами клеточной пролиферации и дифференциации важную роль играет Hippo – киназный сигнальный путь, одним из компонентов которого является Sav1 (гомолог Салвадор 1, известный также как WW45), находящийся, как и большинство других компонентов этого пути в «спящем» состоянии во взрослом организме. Hippo – киназный сигнальный путь играет решающую роль в процессе ретиногенеза – при активации пролонгирует пролиферацию клеток – предшественников, при дезактивации блокирует [12]. Однако есть данные, что Sav1 может инициировать процесс пролиферации взрослых кардиомиоцитов и усиливать регенерацию кардиомиоцитов после инфаркта миокарда [26; 27]. В нашем случае экспрессия Sav1 снизилась.

Снизилась экспрессия генов супрессоров клеточной пролиферации – некдина (Ndn) и фосфатидилинозитола – 5 -фосфата – 4 – киназы (Pip4k2f) и гена супрессора клеточного деления – Fnip1. Увеличилась экспрессия ингибитора орнитин декарбоксилазы (Oaz1), блокирующего синтез полиаминов, ингибирующего процессы клеточной пролиферации и роста [49] в 1,9 раза.

В 2,1 раза увеличилась экспрессия лизоцима (Lyzs), обычно находящегося в «спящем» состоянии [59], и в 2 раза экспрессия гена активатора транскрипции – фактора Hes1 (Hes1), экспрессируемого обычно в клетках – предшественниках и участвующего в регуляции морфогенеза сетчатки, клеточного цикла и клеточной дифференцировки [22].

Снизилась экспрессия генов активаторов транскрипции – Atmin и Lbh – гена, кодирующего LBH транскрипционный активатор и являющегося регулятором дифференциации фоторецепторов через Otx2 [34] и гена спектрина – бета 1 (Spnb1), участвующего в регуляции процессов транскрипции и дифференциации. В отличие от полученных нами данных, на модели кислород-индуцированной ретинопатии было выявлено, что экспрессия гена Spnb1 в сетчатке увеличивается [29].

Снизилась экспрессия Prox1 – транскрипционного фактора, индуцирующего пролиферацию и дифференцировку биполярных, амакринных и горизонтальных клеток сетчатки в период внутриутробного развития. Снизилась экспрессия гена Egr1, который помимо регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, являясь транскрипционным фактором, играет важную роль в нейрональной активности и пластичности [31]. Повышение уровня его экспрессии в сетчатке, выявленное на стрептозотоциновой модели сахарного диабета свидетельствует о его роли в активации микроглии [20].

Повысилась экспрессия генов – гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ядерных белков, ингибирующих транскрипцию РНК в 1,4 раза. На экспериментальной модели кислород – индуцированной ретинопатии было установлено, что в сетчатке снижается экспрессия генов Hist1h2bk, Hist1h2bc, Hist1h2bp, Hist1h2bl, Hist1h2bj, Hist1h2bm, Hist1h2bn [29].

Регуляция процессов трансляции (синтез белка из аминокислот на матрице информационной, матричной РНК) и процессинга РНК (процесс созревания синтезированной на ДНК преРНК и преобразование её в зрелую РНК)

Экспрессия ингибитора трансляции (Gm11961) – антисмысловой РНК увеличилась в 1,8 раза. Действие антисмысловых РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, в связи с этим они получили название антисмысловых (antisense RNA) или micРНК (mRNA interfering complementary RNA – IncRNA). Антисмысловые РНК образуют гибридные комплексы с комплементарными мРНК и препятствуют формированию трансляционного комплекса [69]. Многочисленные IncRNA играют значительную роль в процессе развития сетчатки [17]. Six3os экспрессируется в клетках – предшественниках сетчатки мыши и человека и контролирует экспрессию фактора транскрипции Six3. Подавление его экспрессии приводит к уменьшению количества биполярных клеток и увеличению количества глиальных клеток Мюллера [10; 14; 50; 79; 80]. Gomafu в процессе развития сетчатки регулирует количество формирования амакриновых и глиальных клеток Мюллера [50].

Увеличилась экспрессия гена Prpf19, отвечающего за процессинг РНК в 1,3 раза и одновременно снизилась экспрессия Sentrin/SUMO специфической протеиназы 3 (Senp3), участвующей в созревании рРНК, SUMO модулирует многие пути передачи сигнала (Wnt, цитокины, ростовые факторы, стероидные гормоны) [1].

Снизилась экспрессия генов Pabpn1 и A2bp1, относящихся к классу РНК – связывающих белков, которые соединяются с большим количеством белков – партнеров и практически со всеми мРНК (осуществляют транспорт мРНК в цитоплазму, проверку ее на «значимость» и определяют путь дальнейших преобразований – деградация, трансляция и ее регуляция) [3].

Регуляция процессов трансмембранного переноса белков и микроэлементов

Повысилась экспрессия гена связанного мембранного белка 1 (Tram1) в 1,5 раза, отвечающего за транслокацию (перенос) белков через мембрану.

Увеличилась экспрессия гена, содержащего NIPA-подобный домен 1 (Npal2), отвечающего за трансмембранный перенос малых молекул и гена, отвечающего за ретроградный транспорт эндосом, окислительный стресс и участвующего в формировании аутосомно-доминантной семейной экссудативной витреоретинопатии (Plekhb2) в 1,5 раза.

Снизилась экспрессия гена Bdh2 (в большом количестве экспрессируется в пигментном эпителии, клетках Мюллера и ганглиозных клетках сетчатки) – ингибитора выработки эндогенной 2,5–дигидроксибензойной кислоты, обеспечивающей трансмебранный (плазматическая и митохондриальная мембраны) перенос железа. Железо участвует в метаболизме холестерина в пигментном эпителии сетчатки и играет роль в формировании возрастной макулярной дегенерации. Установлено, что у мышей с дефицитом протеина HFE (гемохроматоз) снижается экспрессия Bdh2 в клетках сетчатки и увеличивается содержание холестерина [11].

Снизилась экспрессия гена Ccs, выполняющего шаперонную функцию – несущего ответственность за поставку меди в супероксиддисмутазу (СОД), при снижении экспрессии Ccs активность СОД снижается на 70–90 %.

Регуляция процесса передачи сигнала (сигналинг)

Увеличилась экспрессия гена миелоидной дифференцировки Myd88 в 1,36. Myd88 является цитозольным адаптерным белком, участвующим в передаче сигнала от всех толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR) за исключением TLR3 [36]. В результате экспериментальных исследований было установлено, что ингибирование Myd88 в пигментном эпителии сетчатки мышей дает положительный результат в лечении сухой формы AMD.

Увеличилась экспрессия гена кальмомодулина 3 (Calm3), кальцийзависимого сигнального белка в 1,29 раза и незначительно повысилась экспрессия генов, связанных с клеточным сигналингом – Wbpil и Smad4. 

Регуляция процессов протеолиза (экстраклеточного, цитоплазматического, протеасомного, лизосомального) и гидролиза

Увеличилась экспрессия гена экстраклеточного протеолиза – матричной металлопротеиназы (Mmp3), отвечающей за деградацию внеклеточного матрикса в 2 раза, цитоплазматического протеолиза – убиквилина 1 (Ubqln1) (установлено, что повышает риск развития болезни Альцгеймера) в 1,45 раза и гена протеасомного протеолиза (Psmd6) в 1,36 раза и снизилась экспрессия гена цитоплазматического убиквитин-протеолиза – Ubeo2o.

Протеасомный (убиквитин-протеасомный) протеолиз – это одна из систем внутриклеточной деградации белков, конъюгированных с убиквитином, участвующих во множестве клеточных процессов, включая регуляцию транскрипции, репарацию ДНК, иммунный ответ и апоптоз [5; 6]. Согласно современным представлениям, протеасомы находятся не только в клетке (ядро, цитоплазма), но и во внеклеточном пространстве. Предполагается, что накопление их в межклеточном пространстве связано с необходимостью «расчистки территории» – избавления от накапливающихся во внеклеточном пространстве белков [9; 58]. За протеасомный протеолиз отвечает многочисленное число генов – Psma6, Psma7, Psma6, Psma7, Psma9 и Psmd13. 

Увеличилась экспрессия генов, отвечающих за лизосомальный протеолиз – гюкозидазы (Gaa) в 1,95 раза, лизоцима – аутофагия (Lyzs) в 1,7 раза (установлена связь лизоцима с нейродегенеративными заболеваниями сетчатки) и маннозидазы (Man2b1) в 1,6 раза.

Одновременно увеличилась экспрессия генов, ингибирующих протеолиз, ингибитора трансмембранных сериновых протеиназ (Serpinb3a) в 3,1 раза, ингибитора цистеиновых протеиназ (Stfa1 и Wfdc2) в 1,9 раза и ингибитора пептидазы 16 (Pi16) – в 1,8 раза. Снизилась экспрессия гена Ulk1 – индуктора процессов аутофагии.

Увеличилась экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический гидролиз (Ndrg3) в 1,7 раза.

Снизилась экспрессия Lос100044692 – гена, отвечающего за катаболизм эндогенных альдегидов. Эндогенные альдегиды образуются в процессе перекисного окисления липидов, гликозилирования и окисления радикалов некоторых свободных аминокислот, обладают высокой цитотоксичностью – формируют ковалентно связанные белки – «вторичные цитотоксические мессенджеры» (при взаимодействии альдегидов с аминогруппами лизина формируется липофусцин), которые за счет ингибирования протеолитической активности протеасом (убиквит-зависимый протеолиз) плохо подвергаются протеолизу и накапливаются в клетках, взаимодействуя с мембранами митохондрий тормозят окислительно – восстановительные процессы в дыхательной цепи митохондрий и угнетают тканевое дыхание. К ферментам, катализирующим процесс катаболизма альдегидов, относятся глутатионтрансфераза и альдозоредуктаза, альдегиддегидрогеназа и альдегидредуктаза [2]. Таким образом, в результате снижения экспрессии Lос100044692 нарушается утилизация эндогенных альдегидов.

Регуляция процесса синаптической передачи

Повысилась экспрессия гена Cd63 (трансмембранный белок), отвечающего за экзоцитоз синаптических везикул в 1,43 раза и гена оксистерол-связывающего белка 2 (Osbp2) – одного из ключевых ферментов холестеринового обмена, участвующего в поддержании липидного состава мембран, связывающего оксистеролы и ингибирующего их цитотоксичность в 1,3 раза. Оксистеролы образуются в синаптических мембранах в результате окислительной модификации холестерина, «покидают» мембраны, связываясь с оксистерол-связывающими белками. Увеличилась экспрессия гена Cинаптотагмин I (Syt1) – мембранного белка синаптических везикул, отвечающего за синаптическую передачу [57; 63; 32], способствующего аксональному разветвлению [25] и участвующего в регенерации аксонов [68] в 1,24 раза. На модели аксональной травмы (краш-синдром) зрительного нерва мышей было установлено, что после травмы увеличивается экспрессия Syt1, авторы предполагают, что индукция экспрессии Syt1 может быть обусловлена регенеративной недостаточностью [55].

Снизилась экспрессия гена Syap1 – cинапс – ассоциированного белка 1, отвечающего за синаптическую передачу и гена Trpm3, играющего важную роль в передаче сигналов во внутренних слоях сетчатки [24; 15].

Регуляция митохондриальных функций

В 1,5 раза увеличилась экспрессия сигнальной митохондриальной пептидазы – ген Sec11a.

Одновременно снизилась экспрессия гена Atp5c1, кодирующего субъединицу митохондриальной АТФ – синтазы – катализатора синтеза АТФ, и гена Atpif1, кодирующего ингибитор митохондриальной АТФ – азы – катализатора отщепления от аденозинтрифосфорной кислоты остатков фосфорной кислоты с освобождением энергии, используемой в процессах трансмембранного переноса и биосинтеза различных соединений, что свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма.

Снизилась экспрессия гена, ответственного за высокую точность воспроизведения генетически заданной структуры белков – гена, кодирующего митохондриальный фермент – фенилаланил-тРНК синтетазу (Fars2) и снизилась экспрессия гена Chchd1, кодирующего белок миторибосом (рибосом митохондрий).

Регуляция метаболических процессов

Уровень экспрессии гена цитохрома P450 (Сyp2a5), отвечающего за процессы окисления, гидроксилирования, метаболизма ретинола (катализатор окисления ретиноевой кислоты в 4–гидрокси-ретиноевую кислоту) повысился в 4,0 раза.

Повысилась экспрессия гена фосфатазы 1 (Ppp1ca) в 1,32 раза, участвующего в регуляции различных метаболических процессов. Установлено, что после экспериментального лигирования центральной артерии сетчатки у крысы увеличивается уровень экспрессии Ppp1ca, Ppp3r1 и Ppp1cc [48].

Увеличилась экспрессия гена орнитин-аминотрансферазы (Oat), катализирующей трансаминирование орнитина и альфа-кетоглутарата в пиролин-5–карбоксилат, глутамин или пролин в 1,5 раза; при дефиците орнитин – аминотрансферазы развивается прогрессирующая хорио-ретинальная дистрофия Gyrate [30].

Снизилась экспрессия гена Gldc (декарбоксилаза глицина), катализирующего образование глицина из глиоксилата; увеличивается экспрессия Gldc в ткани сетчатки при стрептозотоциновом сахарном диабете [20].

Регуляция экспрессии факторов роста и стресс-белков (белки острой фазы воспаления)

Снизилась экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов, являющегося низкоаффинным рецептором нейротрофинов (NGF, BDNF, NT3, NT4) и играющего важную роль в регулировке активности нейротрофиновых Trk-рецепторов, в частности, TrkA.

Повысился уровень экспрессии лактоферрина (Ltf), который является белком острой фазы воспаления и регулирует функции иммунокомпетентных клеток – в 3,7 раза.

Выводы

Таким образом, при интравитреальном введении VEGF:

• нарушается барьерная функция эндотелия сосудов сетчатки за счет снижения экспрессии генов мембранных белков плотного контакта (Ocln и Cldn –1, –2, –3, –5, –10, –11 и –19), генов, которые относятся к мембранным гликопротеинам (Ppap2b) и отвечают за биосинтез гепарансульфата (Ndst1, Hs3st3a1) – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки; за счет увеличения экспрессии гена Gp2, снижающего функции эндотелиального барьера и молекул межклеточной адгезии (Icam-1, –2, Vcam-1, CD44, Cx3cl1в); снижение экспрессии гена St3gal6, участвующего в синтезе лиганда клеточной адгезии E – селектина, вероятно, является компенсаторным;

• меняется экспрессия генов, участвующих в регуляции процесса неоангиогенеза – с одной стороны, компенсаторно увеличивается экспрессия генов – ингибиторов неоваскуляризации (Psen2, Rhbdf1, Tsp1, Igfbp4) и снижается экспрессия генов, стимулирующих ангиогенез – Irs2 и Egr1, с другой стороны, увеличивается экспрессия гена Upp1, обладающего проангиогенными свойствами;

• активируется экспрессия генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14, Krt 6b), клеточного протектора Muc1 и ядерного фибриллярного белка Lmna, обеспечивающих поддерживающую структурную функцию и снижается экспрессия Capns1, участвующего в деградации белков – компонентов цитоскелета, одновременно при этом снижается экспрессия белков – кристаллинов (Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf, Сryge), относящихся также к группе структурных генов;

• снижается экспрессия генов – супрессоров клеточной пролиферации (Sav1, Ndn, Pip4k2f, Fnip1) и увеличивается экспрессия гена Oaz1-ингибитора клеточной пролиферации;

• увеличивается экспрессия генов, имеющих отношение к клеточной дифференцировке (Lyzs, Hes1), находящихся обычно во взрослом организме в «спящем» состоянии; блокируются процессы транскрипции за счет снижения экспрессии генов активаторов транскрипции (Atmin, Lbh, Spnb1, Prox1, Egr1) и увеличения экспрессии генов гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ингибиторов транскрипции;

• увеличивается экспрессия ингибитора трансляции – Gm11961 – антисмысловой РНК и регулируется процесс созревания РНК – увеличивается экспрессия гена Prpf19 и снижается экспрессия Senp3, Pabpn1 и A2bp1с;

• активируется экспрессия генов, отвечающих за трансмембранный перенос белков – Tram1, малых молекул – Npal2, за ретроградный транспорт эндосом – Plekhb2 и снижается экспрессия гена Bdh2 – ингибитора трансмембранного переноса железа (активируется перенос железа) и гена Ccs, отвечающего за поставку меди в СОД (снижается активность фермента);

• активируется процесс передачи сигнала – повышается экспрессия генов – Myd88, Calm3, Wbpil и Smad4;

• увеличивается экспрессия генов, отвечающих за экстраклеточный (Mmp3), цитоплазматический (Ubqln1), протеасомный (Psmd6) и лизосомальный (Gaa, Lyzs, Man2b1) протеолиз и гена, активирующего цитоплазматический гидролиз (Ndrg3); одновременно снижается экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический протеолиз – Ubeo2o, индуктора процессов аутофагии – Ulk1 и увеличивается экспрессия генов, ингибирующих протеолиз – Serpinb3a, Stfa1, Wfdc2, Pi16 и Lос100044692;

• регулируется процесс синаптической передачи – одновременно увеличивается – Cd63, Osbp2, Syt1 и снижается – Syap1, Trpm3 экспрессия генов, отвечающих за синаптическую передачу;

• регулируются митохондриальные функции – увеличивается экспрессия гена сигнальной митохондриальной пептидазы – Sec11a, снижается экспрессия генов митохондриальной АТФ – синтазы – Atp5c1, ингибитора митохондриальной АТФ – азы – Atpif1, фенилаланил-тРНК синтетазы – Fars2 – и гена белка миторибосом Chchd1;

• активируется экспрессия генов, отвечающих за метаболизм – Oat, Ppp1ca и Сyp2a5 (метаболизм ретинола) и снижается экспрессия гена, катализирующего образование глицина – Gldc;

• снижается экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов и повышается уровень экспрессии стресс-белка – лактоферрина (Ltf), регулирующего функции иммунокомпетентных клеток.

VEGF, таким образом, помимо того, что играет важную роль в нарушении функции гематоретинального барьера, обладает еще целым рядом эффектов, представление о которых необходимо иметь на сегодняшний день для повышения эффективности лечения офтальмопатологии, сопровождающейся формированием макулярного отека.

Соотношение экспрессии генов в сетчатке мышей линии C57BL/6J в норме и при интравитреальном введении VEGF (p <0,01)

Продолжение табл.

Окончание табл.