Scientific journal
Научное обозрение. Медицинские науки
ISSN 2500-0780
ПИ №ФС77-57452

CHANGES IN EXPERIMENTAL RETINA TRANSCRIPTOME WHEN THE INTRAVITREAL VEGF

Gavrilova N.A. 1 Gadzhieva N.S. 1 Komova O.Y. 1 Filippova E.V. 1 Goremykina N.B. 1
1 Moscow State University of Medicine and Dentistry n.a. A.I. Evdokimov
Macular edema as a result of violation of the permeability of blood-retinal barrier quite often the cause of low vision and blindness in such a retinal pathology as diabetic retinopathy, wet form of age-related macular degeneration and retinal vein occlusion. In violation of the blood-retinal barrier at each of these pathologies play an important role vaskuloendotelialny growth factor. The analysis of changes in the retina transcriptome in C57BL / 6J mice line with intravitreal injection of VEGF165. Identified genes whose expression level was significantly (p < 0,01) changed – the genes of membrane proteins close contact and intercellular adhesion molecules, genes involved in the regulation of neoangiogenesis, structural cellular function, cell proliferation, transcription, differentiation, transmembrane transport protein and trace elements, signaling, synaptic transmissionprocesses and other.
retina
blood-retinal barrier
endothelial growth factor
gene expression

Макулярный отек в результате нарушения проницаемости гематоретинального барьера достаточно часто является причиной слабовидения и потери зрения у лиц преимущественно трудоспособного возраста при такой патологии сетчатки как диабетическая ретинопатия, влажная форма возрастной макулярной дегенерации и окклюзия вен сетчатки.

В нарушении гематоретинального барьера при каждой из данных патологий важную роль играет васкулоэндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor – VEGF) [21; 23; 45; 56; 65]. Современный уровень развития технологий позволяет на сегодняшний день проводить изучение молекулярно-генетических основ формирования патологии и идентифицировать ключевые регуляторные механизмы, участвующие в наступлении эффектов от проводимого лечения. Изучение молекулярных механизмов влияния VEGF на сетчатку позволит получить дополнительное представление не только о механизмах развития патологии, связанной с этим фактором, но и механизмах проведения лечения (анти VEGF – терапия, лазеркоагуляция) и повышения его эффективности, поможет идентифицировать гены для разработки будущих терапевтических стратегий.

Цель – исследовать изменения экспрессии генов в сетчатке при интравитреальном введении VEGF в эксперименте.

Материалы и методы исследования

Работу проводили на 4–5 недельных самцах мышей линии C57BL/6J.

Результаты исследования генотипа мыши свидетельствуют, что 80 % генов этого животного и человека идентичны и 99 % генов очень похожи, длина генетического кода мыши меньше, чем человека всего лишь на 14 % [16]. В связи с этим лабораторные мыши являются основной моделью для проведения биомедицинских исследований. При проведении исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико – биологических исследований с использованием животных». Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 1996).

Под общим наркозом (внутрибрюшинная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) с помощью шприца Hamilton было произведено интравитреальное введение рекомбинантного VEGF165 (R & D Systems) 50 нг/мл в 2 мкл фосфатно-солевого буферного раствора PBS (6 глаз), в контрольные глаза вводили PBS (6 глаз). Установлено, что через 24 часа после интравитреального введения 50 нг/мл VEGF животным сосудистая проницаемость увеличивается более, чем в 3 раза [41; 53; 62; 76].

Через сутки после введения VEGF выделенные образцы тканей (нейроэпителий, пигментный эпителий) были переданы для транскрипционного анализа в ЗАО «Геноаналитика» (Москва).

Суммарную РНК из выделенных образцов тканей экстрагировали с помощью реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Количество полученной общей РНК оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop (NanoDrop Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. Качество РНК проверяли с помощью чипа Agilent Total RNA Nano 6000 (Agilent Technologies, США). По 400 нг общей РНК каждого образца амплифицировали с помощью Illumina® TotalPrep ™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированную РНК гибридизовали с MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChips (Illumina) в соответствии с протоколом Illumina. Анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения GenomeStudio (Illumina, США), модуля экспрессии генов. Для интерпретации результатов транскрипционного анализа использовали транскрипты с параметром Detection_Pval < 0,01. Результаты считались значимыми при p <0,01.

Результаты исследования и их обсуждение

Регуляция экспрессии генов мембранных белков плотного контакта

Выявлено снижение экспрессии генов мембранных белков плотного контакта Ocln и Cldn –1, –2, –3, –5, –10, – 11 и 19, которые экспрессируются в эндотелии сосудов сетчатки и пигментном эпителии и обеспечивают их барьерные функции [33; 42].

В предыдущих экспериментальных работах было установлено, что в эндотелии сосудов сетчатки снижается экспрессия окклюдина и клаудинов -1 и -3 при использовании VEGF и при экспериментальном аутоиммуном ретините [18; 19; 75]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии, наоборот, было выявлено, что экспрессия клаудинов -1, -2 и -5 увеличивается и полученный результат авторы связывают с формированием неоваскуляризации [39]. На культуре фетальных клеток пигментного эпителия было установлено, что VEGF на экспрессию Cldn -3,- 10 и 19 существенно не влияет [44]. При культивировании клеток пигментного эпителия в условиях высокой концентрации глюкозы и гипоксии снижается экспрессия окклюдина и клаудина-1 [70]. Полученные нами данные могут свидетельствовать о снижении экспрессии генов мембранных белков плотного контакта, как в эндотелии сосудов сетчатки, так и в пигментном эпителии.

Снизилась экспрессия гена Ppap2b (Lpp3), который относится к мембранным гликопротеинам и отвечает за межклеточную адгезию эндотелиальных клеток. Установлено, что при инактивации LPP3 в эндотелии сосудов сосудистая проницаемость увеличивается в 2 раза [43].

Снизилась экспрессия генов Ndst1, кодирующего гепарансульфат и Hs3st3a1, отвечающего за биосинтез гепарансульфата – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки.

В 8 раз увеличилась экспрессия гранулярного мембранного белка – гликопротеина 2 (Gp2), который активирует эндотелиальные клетки и снижает функции эндотелиального барьера.

Регуляция экспрессии генов молекул межклеточной адгезии

Увеличилась экспрессия молекул межклеточной адгезии Icam-1 и 2 в 2,1 и 5,2 раза, Vcam-1 в 3,2 раза, CD44 в 6 раз и хемокина – Cx3cl1 в 3,2 раза, что свидетельствует об усилении процессов межклеточных взаимодействий и клеточной адгезии. Роль молекулы CX3C, принадлежащей к подсемейству хемокинов в формировании сосудистой патологии сетчатки меньше всего изучена, в связи с этим приводим данные только по данной молекуле. Установлено, что CX3CL1 стимулирует неоангиогенез у мышей с кислород-индуцированной ретинопатией, уровень его содержания увеличивается у пациентов в стекловидном теле при пролиферативной диабетической ретинопатии [78], у мышей с экспериментальным диабетом увеличивается уровень его экспрессии в сетчатке [54].

Экспрессия гена St3gal6, который играет ключевую роль в синтезе сиалил-лиганда клеточной адгезии E – селектина, выполняющего важную роль в инициации связывания лейкоцитов с эндотелием снизилась.

Регуляция неоангиогенеза

Увеличилась экспрессия генов Rhbdf1 в 1,5 раза и Psen2 – в 325 раз. Rhbdf1 принадлежит к семейству сериновых протеиназ (ромбоидов), расщепляющих белки, аналогичные эпидермальному фактору роста и в связи с этим обладает антиангиогенными свойствами. Psen2 – пресенилин-2 относится к семейству аспартатных протеиназ, расщепляющих внутримембранные рецепторные белки 1 типа и тоже обладает антиангиогенными свойствами, участвуя в реализации эффектов Notch сигнального пути, блокирующего ангиогенез. Установлено, что при повышении активности Notch сигнального пути формирование лазер-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации блокируется и, наоборот, при его ингибировании активируется [7]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии установлено, что в сетчатке увеличивается уровень экспрессии Psen2 [38] и Rhbdf1 [29].

Увеличилась экспрессия Tsp1 в 1,2 раза. Тромбоспондин-1 – белок внеклеточного матрикса, ингибирует эндотелиальную клеточную пролиферацию, миграцию и ангиогенез. На модели кислород-индуцированной ретинопатии было установлено, что в период активного формирования неоваскуляризации в эндотелии ретинальных сосудов экспрессия TSP-1 увеличивается; при дополнительной VEGF стимуляции наблюдается сначала снижение его экспрессии, затем наоборот, увеличение в 3 раза по принципу отрицательной обратной связи [64].

Повысилась экспрессия гена Igfbp4 – ИФР – связывающего белка, типа 4 в 1,24 раза. Igfbp4, образует комплекс с инсулиноподобным фактором роста 1 и не позволяет ему связаться с «родными» рецепторами на клетках-мишенях, блокируя тем самым его эффект – стимулировать неоангиогенез. На экспериментальной модели кислород-индуцированной ретинопатии различными авторами было выявлено увеличение экспрессии в сетчатке различных типов ИФР – связующих белков. Одни авторы выявили увеличение экспрессии Igfbp2, Igfbp4 и Igfbp5 на фоне низкой экспрессии Igfbp3 и Igfbp6 [71], другие – увеличение экспрессии Igfbp3 более чем в 5 раз в областях формирования неоваскуляризации [35]. У пациентов с непролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией в стекловидном теле выявлено увеличение концентрации Igfbp2 и Igfbp3 в 1,5 и 13 раз, соответственно [40; 46; 60].

Снизилась экспрессия гена Irs2, кодирующего субстрат инсулинового рецептора 2 и участвующего в реализации физиологических функций инсулина и факторов роста [74].

Снизилась экспрессия Egr1, участвующего в передаче сигналов VEGF-A/VEGFR2 и регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, при его блокаде, с использованием NAB2, VEGF-индуцированная экспрессия генов в эндотелиальных клетках снижается и ангиогенез ингибируется [37; 52].

Увеличилась экспрессия уридин-фосфорилазы 1 (Upp1) в 2,6 раза. Уридин-фосфорилаза входит в состав класса пиримидиновых нуклеозидфосфорилаз, катализирует реакцию расщепления гликозидной связи в уридине и обладает выраженными проангиогенными свойствами. Установлено, что в результате блокады уридин – фосфорилазы блокируется лазериндуцированная хориоидальная неоваскуляризация [77].

Регуляция структурных клеточных функций

Повысилась экспрессия 7 генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17 – в 4,8, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14 и Krt 6b, соответственно, в 3,0 -2,7– 2,5– 2,3– 2,2 и 1,5 раза). Промежуточные филаменты играют важную роль в поддержании структурной целостности внутренних слоев сетчатки, особенно клеток Мюллера. При аргон-лазерной коагуляции сетчатки в ганглиозном слое и слое нервных волокон было выявлено повышение уровня экспрессии Krt 1–12 [13]. В сетчатке крыс OXYS (преждевременно стареющие крысы) в возрасте 3 месяцев экспрессия Krt 1–12, наоборот снижается, что с точки зрения автора свидетельствует о нарушении взаимодействий между клетками и внеклеточным матриксом [4].

В 3,1 раза повысился уровень экспрессии муцина 1 (Muc1) – трансмембранного гликопротеина, входящего в состав волокон клеток Мюллера, формирующих наружную и внутреннюю пограничные мембраны и выполняющего функции клеточного протектора [67].

Увеличилась экспрессия гена ядерной ламины (фибриллярный белок) (Lmna), также обеспечивающего структурную функцию.

Экспрессия кальпаина 1 (Capns1) увеличилась в 1,75 раза, установлена его связь с нейродегенеративными процессами и пигментным ретинитом. Кальпаины – Са2+--зависимые цистеиновые протеиназы, осуществляют деградацию белков, являющихся компонентами цитоскелета [4]. Содержатся в нервной ткани в двух формах – растворимой и мембраносвязанной, которая преимущественно ассоциирована с миелином и обнаруживается в синаптических мембранах, расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин и миофибриллярные белки.

Экспрессия белков – кристаллинов – Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf и Сryge, относящихся к группе структурных генов. Функция кристаллинов заключается в защите белков от неправильного сворачивания и аггрегации, т.е. они являются шаперонами. На экспериментальных моделях глаукомы было выявлено наличие снижения экспрессии белков-кристаллинов в сетчатке [8; 47; 61], в сетчатке крыс OXYS экспрессия кристаллинов Сrygb, Crygs, Cryab, Cryba2 и Crygd снижается в 10 раз [4]. На моделях животных при лазерной коагуляции сетчатки, повреждении зрительного нерва и стрептозотоциновом диабете выявлено, наоборот повышение экспрессии кристаллинов [13; 28; 51; 72]. Xi J. с соавт. [73] и Templeton J.P. с соавт. [66] считают, что интерпретировать различия в экспрессии кристаллина в сетчатке следует с осторожностью, так как они значительно варьируются и зависят от инициирующего стимула.

Регуляция процессов клеточной пролиферации транскрипции (построение РНК по комплементарной ДНК) и дифференциации

В обеспечении скоординированного баланса между процессами клеточной пролиферации и дифференциации важную роль играет Hippo – киназный сигнальный путь, одним из компонентов которого является Sav1 (гомолог Салвадор 1, известный также как WW45), находящийся, как и большинство других компонентов этого пути в «спящем» состоянии во взрослом организме. Hippo – киназный сигнальный путь играет решающую роль в процессе ретиногенеза – при активации пролонгирует пролиферацию клеток – предшественников, при дезактивации блокирует [12]. Однако есть данные, что Sav1 может инициировать процесс пролиферации взрослых кардиомиоцитов и усиливать регенерацию кардиомиоцитов после инфаркта миокарда [26; 27]. В нашем случае экспрессия Sav1 снизилась.

Снизилась экспрессия генов супрессоров клеточной пролиферации – некдина (Ndn) и фосфатидилинозитола – 5 -фосфата – 4 – киназы (Pip4k2f) и гена супрессора клеточного деления – Fnip1. Увеличилась экспрессия ингибитора орнитин декарбоксилазы (Oaz1), блокирующего синтез полиаминов, ингибирующего процессы клеточной пролиферации и роста [49] в 1,9 раза.

В 2,1 раза увеличилась экспрессия лизоцима (Lyzs), обычно находящегося в «спящем» состоянии [59], и в 2 раза экспрессия гена активатора транскрипции – фактора Hes1 (Hes1), экспрессируемого обычно в клетках – предшественниках и участвующего в регуляции морфогенеза сетчатки, клеточного цикла и клеточной дифференцировки [22].

Снизилась экспрессия генов активаторов транскрипции – Atmin и Lbh – гена, кодирующего LBH транскрипционный активатор и являющегося регулятором дифференциации фоторецепторов через Otx2 [34] и гена спектрина – бета 1 (Spnb1), участвующего в регуляции процессов транскрипции и дифференциации. В отличие от полученных нами данных, на модели кислород-индуцированной ретинопатии было выявлено, что экспрессия гена Spnb1 в сетчатке увеличивается [29].

Снизилась экспрессия Prox1 – транскрипционного фактора, индуцирующего пролиферацию и дифференцировку биполярных, амакринных и горизонтальных клеток сетчатки в период внутриутробного развития. Снизилась экспрессия гена Egr1, который помимо регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, являясь транскрипционным фактором, играет важную роль в нейрональной активности и пластичности [31]. Повышение уровня его экспрессии в сетчатке, выявленное на стрептозотоциновой модели сахарного диабета свидетельствует о его роли в активации микроглии [20].

Повысилась экспрессия генов – гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ядерных белков, ингибирующих транскрипцию РНК в 1,4 раза. На экспериментальной модели кислород – индуцированной ретинопатии было установлено, что в сетчатке снижается экспрессия генов Hist1h2bk, Hist1h2bc, Hist1h2bp, Hist1h2bl, Hist1h2bj, Hist1h2bm, Hist1h2bn [29].

Регуляция процессов трансляции (синтез белка из аминокислот на матрице информационной, матричной РНК) и процессинга РНК (процесс созревания синтезированной на ДНК преРНК и преобразование её в зрелую РНК)

Экспрессия ингибитора трансляции (Gm11961) – антисмысловой РНК увеличилась в 1,8 раза. Действие антисмысловых РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, в связи с этим они получили название антисмысловых (antisense RNA) или micРНК (mRNA interfering complementary RNA – IncRNA). Антисмысловые РНК образуют гибридные комплексы с комплементарными мРНК и препятствуют формированию трансляционного комплекса [69]. Многочисленные IncRNA играют значительную роль в процессе развития сетчатки [17]. Six3os экспрессируется в клетках – предшественниках сетчатки мыши и человека и контролирует экспрессию фактора транскрипции Six3. Подавление его экспрессии приводит к уменьшению количества биполярных клеток и увеличению количества глиальных клеток Мюллера [10; 14; 50; 79; 80]. Gomafu в процессе развития сетчатки регулирует количество формирования амакриновых и глиальных клеток Мюллера [50].

Увеличилась экспрессия гена Prpf19, отвечающего за процессинг РНК в 1,3 раза и одновременно снизилась экспрессия Sentrin/SUMO специфической протеиназы 3 (Senp3), участвующей в созревании рРНК, SUMO модулирует многие пути передачи сигнала (Wnt, цитокины, ростовые факторы, стероидные гормоны) [1].

Снизилась экспрессия генов Pabpn1 и A2bp1, относящихся к классу РНК – связывающих белков, которые соединяются с большим количеством белков – партнеров и практически со всеми мРНК (осуществляют транспорт мРНК в цитоплазму, проверку ее на «значимость» и определяют путь дальнейших преобразований – деградация, трансляция и ее регуляция) [3].

Регуляция процессов трансмембранного переноса белков и микроэлементов

Повысилась экспрессия гена связанного мембранного белка 1 (Tram1) в 1,5 раза, отвечающего за транслокацию (перенос) белков через мембрану.

Увеличилась экспрессия гена, содержащего NIPA-подобный домен 1 (Npal2), отвечающего за трансмембранный перенос малых молекул и гена, отвечающего за ретроградный транспорт эндосом, окислительный стресс и участвующего в формировании аутосомно-доминантной семейной экссудативной витреоретинопатии (Plekhb2) в 1,5 раза.

Снизилась экспрессия гена Bdh2 (в большом количестве экспрессируется в пигментном эпителии, клетках Мюллера и ганглиозных клетках сетчатки) – ингибитора выработки эндогенной 2,5–дигидроксибензойной кислоты, обеспечивающей трансмебранный (плазматическая и митохондриальная мембраны) перенос железа. Железо участвует в метаболизме холестерина в пигментном эпителии сетчатки и играет роль в формировании возрастной макулярной дегенерации. Установлено, что у мышей с дефицитом протеина HFE (гемохроматоз) снижается экспрессия Bdh2 в клетках сетчатки и увеличивается содержание холестерина [11].

Снизилась экспрессия гена Ccs, выполняющего шаперонную функцию – несущего ответственность за поставку меди в супероксиддисмутазу (СОД), при снижении экспрессии Ccs активность СОД снижается на 70–90 %.

Регуляция процесса передачи сигнала (сигналинг)

Увеличилась экспрессия гена миелоидной дифференцировки Myd88 в 1,36. Myd88 является цитозольным адаптерным белком, участвующим в передаче сигнала от всех толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR) за исключением TLR3 [36]. В результате экспериментальных исследований было установлено, что ингибирование Myd88 в пигментном эпителии сетчатки мышей дает положительный результат в лечении сухой формы AMD.

Увеличилась экспрессия гена кальмомодулина 3 (Calm3), кальцийзависимого сигнального белка в 1,29 раза и незначительно повысилась экспрессия генов, связанных с клеточным сигналингом – Wbpil и Smad4. 

Регуляция процессов протеолиза (экстраклеточного, цитоплазматического, протеасомного, лизосомального) и гидролиза

Увеличилась экспрессия гена экстраклеточного протеолиза – матричной металлопротеиназы (Mmp3), отвечающей за деградацию внеклеточного матрикса в 2 раза, цитоплазматического протеолиза – убиквилина 1 (Ubqln1) (установлено, что повышает риск развития болезни Альцгеймера) в 1,45 раза и гена протеасомного протеолиза (Psmd6) в 1,36 раза и снизилась экспрессия гена цитоплазматического убиквитин-протеолиза – Ubeo2o.

Протеасомный (убиквитин-протеасомный) протеолиз – это одна из систем внутриклеточной деградации белков, конъюгированных с убиквитином, участвующих во множестве клеточных процессов, включая регуляцию транскрипции, репарацию ДНК, иммунный ответ и апоптоз [5; 6]. Согласно современным представлениям, протеасомы находятся не только в клетке (ядро, цитоплазма), но и во внеклеточном пространстве. Предполагается, что накопление их в межклеточном пространстве связано с необходимостью «расчистки территории» – избавления от накапливающихся во внеклеточном пространстве белков [9; 58]. За протеасомный протеолиз отвечает многочисленное число генов – Psma6, Psma7, Psma6, Psma7, Psma9 и Psmd13. 

Увеличилась экспрессия генов, отвечающих за лизосомальный протеолиз – гюкозидазы (Gaa) в 1,95 раза, лизоцима – аутофагия (Lyzs) в 1,7 раза (установлена связь лизоцима с нейродегенеративными заболеваниями сетчатки) и маннозидазы (Man2b1) в 1,6 раза.

Одновременно увеличилась экспрессия генов, ингибирующих протеолиз, ингибитора трансмембранных сериновых протеиназ (Serpinb3a) в 3,1 раза, ингибитора цистеиновых протеиназ (Stfa1 и Wfdc2) в 1,9 раза и ингибитора пептидазы 16 (Pi16) – в 1,8 раза. Снизилась экспрессия гена Ulk1 – индуктора процессов аутофагии.

Увеличилась экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический гидролиз (Ndrg3) в 1,7 раза.

Снизилась экспрессия Lос100044692 – гена, отвечающего за катаболизм эндогенных альдегидов. Эндогенные альдегиды образуются в процессе перекисного окисления липидов, гликозилирования и окисления радикалов некоторых свободных аминокислот, обладают высокой цитотоксичностью – формируют ковалентно связанные белки – «вторичные цитотоксические мессенджеры» (при взаимодействии альдегидов с аминогруппами лизина формируется липофусцин), которые за счет ингибирования протеолитической активности протеасом (убиквит-зависимый протеолиз) плохо подвергаются протеолизу и накапливаются в клетках, взаимодействуя с мембранами митохондрий тормозят окислительно – восстановительные процессы в дыхательной цепи митохондрий и угнетают тканевое дыхание. К ферментам, катализирующим процесс катаболизма альдегидов, относятся глутатионтрансфераза и альдозоредуктаза, альдегиддегидрогеназа и альдегидредуктаза [2]. Таким образом, в результате снижения экспрессии Lос100044692 нарушается утилизация эндогенных альдегидов.

Регуляция процесса синаптической передачи

Повысилась экспрессия гена Cd63 (трансмембранный белок), отвечающего за экзоцитоз синаптических везикул в 1,43 раза и гена оксистерол-связывающего белка 2 (Osbp2) – одного из ключевых ферментов холестеринового обмена, участвующего в поддержании липидного состава мембран, связывающего оксистеролы и ингибирующего их цитотоксичность в 1,3 раза. Оксистеролы образуются в синаптических мембранах в результате окислительной модификации холестерина, «покидают» мембраны, связываясь с оксистерол-связывающими белками. Увеличилась экспрессия гена Cинаптотагмин I (Syt1) – мембранного белка синаптических везикул, отвечающего за синаптическую передачу [57; 63; 32], способствующего аксональному разветвлению [25] и участвующего в регенерации аксонов [68] в 1,24 раза. На модели аксональной травмы (краш-синдром) зрительного нерва мышей было установлено, что после травмы увеличивается экспрессия Syt1, авторы предполагают, что индукция экспрессии Syt1 может быть обусловлена регенеративной недостаточностью [55].

Снизилась экспрессия гена Syap1 – cинапс – ассоциированного белка 1, отвечающего за синаптическую передачу и гена Trpm3, играющего важную роль в передаче сигналов во внутренних слоях сетчатки [24; 15].

Регуляция митохондриальных функций

В 1,5 раза увеличилась экспрессия сигнальной митохондриальной пептидазы – ген Sec11a.

Одновременно снизилась экспрессия гена Atp5c1, кодирующего субъединицу митохондриальной АТФ – синтазы – катализатора синтеза АТФ, и гена Atpif1, кодирующего ингибитор митохондриальной АТФ – азы – катализатора отщепления от аденозинтрифосфорной кислоты остатков фосфорной кислоты с освобождением энергии, используемой в процессах трансмембранного переноса и биосинтеза различных соединений, что свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма.

Снизилась экспрессия гена, ответственного за высокую точность воспроизведения генетически заданной структуры белков – гена, кодирующего митохондриальный фермент – фенилаланил-тРНК синтетазу (Fars2) и снизилась экспрессия гена Chchd1, кодирующего белок миторибосом (рибосом митохондрий).

Регуляция метаболических процессов

Уровень экспрессии гена цитохрома P450 (Сyp2a5), отвечающего за процессы окисления, гидроксилирования, метаболизма ретинола (катализатор окисления ретиноевой кислоты в 4–гидрокси-ретиноевую кислоту) повысился в 4,0 раза.

Повысилась экспрессия гена фосфатазы 1 (Ppp1ca) в 1,32 раза, участвующего в регуляции различных метаболических процессов. Установлено, что после экспериментального лигирования центральной артерии сетчатки у крысы увеличивается уровень экспрессии Ppp1ca, Ppp3r1 и Ppp1cc [48].

Увеличилась экспрессия гена орнитин-аминотрансферазы (Oat), катализирующей трансаминирование орнитина и альфа-кетоглутарата в пиролин-5–карбоксилат, глутамин или пролин в 1,5 раза; при дефиците орнитин – аминотрансферазы развивается прогрессирующая хорио-ретинальная дистрофия Gyrate [30].

Снизилась экспрессия гена Gldc (декарбоксилаза глицина), катализирующего образование глицина из глиоксилата; увеличивается экспрессия Gldc в ткани сетчатки при стрептозотоциновом сахарном диабете [20].

Регуляция экспрессии факторов роста и стресс-белков (белки острой фазы воспаления)

Снизилась экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов, являющегося низкоаффинным рецептором нейротрофинов (NGF, BDNF, NT3, NT4) и играющего важную роль в регулировке активности нейротрофиновых Trk-рецепторов, в частности, TrkA.

Повысился уровень экспрессии лактоферрина (Ltf), который является белком острой фазы воспаления и регулирует функции иммунокомпетентных клеток – в 3,7 раза.

Выводы

Таким образом, при интравитреальном введении VEGF:

• нарушается барьерная функция эндотелия сосудов сетчатки за счет снижения экспрессии генов мембранных белков плотного контакта (Ocln и Cldn –1, –2, –3, –5, –10, –11 и –19), генов, которые относятся к мембранным гликопротеинам (Ppap2b) и отвечают за биосинтез гепарансульфата (Ndst1, Hs3st3a1) – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки; за счет увеличения экспрессии гена Gp2, снижающего функции эндотелиального барьера и молекул межклеточной адгезии (Icam-1, –2, Vcam-1, CD44, Cx3cl1в); снижение экспрессии гена St3gal6, участвующего в синтезе лиганда клеточной адгезии E – селектина, вероятно, является компенсаторным;

• меняется экспрессия генов, участвующих в регуляции процесса неоангиогенеза – с одной стороны, компенсаторно увеличивается экспрессия генов – ингибиторов неоваскуляризации (Psen2, Rhbdf1, Tsp1, Igfbp4) и снижается экспрессия генов, стимулирующих ангиогенез – Irs2 и Egr1, с другой стороны, увеличивается экспрессия гена Upp1, обладающего проангиогенными свойствами;

• активируется экспрессия генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14, Krt 6b), клеточного протектора Muc1 и ядерного фибриллярного белка Lmna, обеспечивающих поддерживающую структурную функцию и снижается экспрессия Capns1, участвующего в деградации белков – компонентов цитоскелета, одновременно при этом снижается экспрессия белков – кристаллинов (Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf, Сryge), относящихся также к группе структурных генов;

• снижается экспрессия генов – супрессоров клеточной пролиферации (Sav1, Ndn, Pip4k2f, Fnip1) и увеличивается экспрессия гена Oaz1-ингибитора клеточной пролиферации;

• увеличивается экспрессия генов, имеющих отношение к клеточной дифференцировке (Lyzs, Hes1), находящихся обычно во взрослом организме в «спящем» состоянии; блокируются процессы транскрипции за счет снижения экспрессии генов активаторов транскрипции (Atmin, Lbh, Spnb1, Prox1, Egr1) и увеличения экспрессии генов гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ингибиторов транскрипции;

• увеличивается экспрессия ингибитора трансляции – Gm11961 – антисмысловой РНК и регулируется процесс созревания РНК – увеличивается экспрессия гена Prpf19 и снижается экспрессия Senp3, Pabpn1 и A2bp1с;

• активируется экспрессия генов, отвечающих за трансмембранный перенос белков – Tram1, малых молекул – Npal2, за ретроградный транспорт эндосом – Plekhb2 и снижается экспрессия гена Bdh2 – ингибитора трансмембранного переноса железа (активируется перенос железа) и гена Ccs, отвечающего за поставку меди в СОД (снижается активность фермента);

• активируется процесс передачи сигнала – повышается экспрессия генов – Myd88, Calm3, Wbpil и Smad4;

• увеличивается экспрессия генов, отвечающих за экстраклеточный (Mmp3), цитоплазматический (Ubqln1), протеасомный (Psmd6) и лизосомальный (Gaa, Lyzs, Man2b1) протеолиз и гена, активирующего цитоплазматический гидролиз (Ndrg3); одновременно снижается экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический протеолиз – Ubeo2o, индуктора процессов аутофагии – Ulk1 и увеличивается экспрессия генов, ингибирующих протеолиз – Serpinb3a, Stfa1, Wfdc2, Pi16 и Lос100044692;

• регулируется процесс синаптической передачи – одновременно увеличивается – Cd63, Osbp2, Syt1 и снижается – Syap1, Trpm3 экспрессия генов, отвечающих за синаптическую передачу;

• регулируются митохондриальные функции – увеличивается экспрессия гена сигнальной митохондриальной пептидазы – Sec11a, снижается экспрессия генов митохондриальной АТФ – синтазы – Atp5c1, ингибитора митохондриальной АТФ – азы – Atpif1, фенилаланил-тРНК синтетазы – Fars2 – и гена белка миторибосом Chchd1;

• активируется экспрессия генов, отвечающих за метаболизм – Oat, Ppp1ca и Сyp2a5 (метаболизм ретинола) и снижается экспрессия гена, катализирующего образование глицина – Gldc;

• снижается экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов и повышается уровень экспрессии стресс-белка – лактоферрина (Ltf), регулирующего функции иммунокомпетентных клеток.

VEGF, таким образом, помимо того, что играет важную роль в нарушении функции гематоретинального барьера, обладает еще целым рядом эффектов, представление о которых необходимо иметь на сегодняшний день для повышения эффективности лечения офтальмопатологии, сопровождающейся формированием макулярного отека.

Соотношение экспрессии генов в сетчатке мышей линии C57BL/6J в норме и при интравитреальном введении VEGF (p <0,01)

Символ

Название

Соотношение (Ratio)

1

2

3

LOC100041004 (PSEN2)

Presenilin-2 

325

CLDN11

Claudin 11

14,212

CLDN1

Claudin 1

8,205

GP2 

Pancreatic zymogen granule membrane protein GP-2

8,074

CD44

CD44 antigen

6,123

ICAM-2

Intercellular adhesion molecule 2

5,233

KRT17 

Keratin 17

4,811

CYP2A5

cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 5 

4,020

LTF

Lactoferrin

3,758

VCAM-1

Vascular cell adhesion protein 1

3,215

CX3CL1B

Chemokine (C-X3–C motif) ligand 1 (Fractalkine)

3,243

MUC1 

Mucin 1, cell surface associated

3,130

SERPINB3A

Serine peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 3A

3,116

KRT19

Keratin 19

2,983

KRT13

Keratin 13

2,680

UPP1

Uridine phosphorylase 1 

2,576

KRT23

Keratin 23 (histone deacetylase inducible)

2,477

CLDN19

Claudin 19

2,333

KRT15

Keratin 15

2,296

KRT14

Keratin 14

2,239

ICAM-1

Intercellular adhesion molecule 1

2,151

LYZ

Lysozymes

2,149

MMP3

Matrix metallopeptidase 3 

2,042

HES1

Transcription factor HES1 (hairy and enhancer of split-1)

2,011

GAA

Acid alpha-glucosidase 

1,952

WFDC2

WAP (whey acidic protein)four-disulfide core domain protein 2

1,904

STFA1

Stefin A1 

1,868

LOC100045697 (OAZ1)

Оrnithine decarboxylase antizyme

1,859

PI16

Peptidase inhibitor 16

1,810

OTTMUSG00000005065

syn. Gm11961 (antisense lncRNA gene)

1,768

CAPNS1

Calpain small subunit 1

1,751

LYZS

LysozymeS

1,711

C130090K23RIK

RIKEN к ДНК C130090K23 gene

1,692

NDRG3

N-myc downstream-regulated gene 3 protein

1,678

CLDN2

Claudin 2

1,613

MAN2B1

Mannosidase alpha class 2B member 1

1,564

NPAL2

NIPA-Like Domain Containing 2

1,541

PLEKHB2

Pleckstrin homology domain-containing family B member 2 

1,523

TRAM1

Translocation associated membrane protein 1

1,521

KRT6B

Keratin 6B

1,494

Продолжение табл.

1

2

3

LMNA

Lamin A

1,475

SEC11A

SEC11 Homolog A, Signal Peptidase Complex Subunit

1,468

OAT

Ornithine aminotransferase 

1,467

RHBDF1

Inactive rhomboid protein 1 (iRhom1)

1,463

UBQLN1

Ubiquilin 1

1,453

HIST1H2BF

Histone Cluster 1,H2bf

1,440

CD63

CD63 antigen

1,427

HIST1H2BJ

Histone Cluster 1,H2bj

1,415

PSMB6

Proteasome subunit beta type-6 (subunit beta-1)

1,365

MYD88

Myeloid differentiation primary response gene 88

1,364

PPP1CA

Protein phosphatase 1, catalytic subunit, alpha isoform

1,321

PRPF19

Pre-mRNA-processing factor 19

1,306

CALM3

Calmodulin 3

1,294

OSBP2

Oxysterol-binding protein 2 

1,294

OCLN

Occludin

1,259

CLDN10

Claudin 10

1,251

CLDN3

Claudin -3

1,248

SYT1

Synaptotagmin I

1,239

IGFBP4

Insulin-like growth factor-binding protein 4 

1,236

TSP1

Thrombospondin-1

1,228

D19WSU162E (WBP1L)

WW domain binding protein 1–like

1,181

CLDN5

Claudin 5

1,173

LOC100048076 (Smad4)

Similar to MAD (Mothers against decapentaplegic) homolog 4

0,805

PPAP2B

Lipid phosphate phosphohydrolase 3

–1,487

HNRPL

Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein L

–1,139

LOC100044692

Similar to aldehyde reductase

–1,139

PABPN1

Polyadenylate-binding nuclear protein 1 

–1,131

NDN

Necdin

–1,127

ATP5C1

ATP synthase

–1,126

ATPIF1

ATPase inhibitory factor 1

–1,126

SAV1

Salvador homolog 1

–1,122

SYAP1

Synapse-associated protein 1 

–1,110

PIP4K2A

Phosphatidylinositol-5–phosphate 4–kinase type-2 alpha

–1,110

CHCHD1

Сoiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 1

–1,109

ATMIN

ATM Interactor

–1,105

ACD

Adrenocortical dysplasia protein homolog

–1,100

SENP3

Sentrin/SUMO (Small ubiquitin-like modifier)-specific protease 3

–0,993

NGFRAP1

Nerve growth factor receptor

–0,991

D9ERTD392E

D9ERTD392E, syn. CCPG1 – cell cycle progression 1

–0,979

LBH

Limb bud and heart development (LBH-like)

–0,976

FARS2

Phenylalanyl-tRNA synthetase

–0,970

SPNB1

Spectrin beta 1 

–0,968

FNIP1

Folliculin Interacting Protein 1

–0,965

A2BP1

Ataxin 2–binding protein 1

–0,955

ULK1

Serine/threonine-protein kinase 

–0,945

TXNDC15

Thioredoxin domain-containing protein 15

–0,943

EGR1

Early growth response protein 1

–0,938

CCS

Сopper chaperone for superoxide dismutase

–0,937

COL6A1

Collagen alpha-1(VI) chain

–0,932

4933407N01RIK

RIKEN cDNA 4933407N01 gene

–0,929

Окончание табл.

1

2

3

BDH2

3 Hydroxybutyrate Dehydrogenase, type 2 

–0,892

NDST1

N-deacetylase/N-sulfotransferase (heparan glucosaminyl) 1

–0,889

LOC216443

Methionyl-tRNA synthetase

–0,874

HS3ST3A1

Heparan sulfate-glucosamine 3–sulfotransferase 3A1

–0,869

UBE2O

Ubiquitin-conjugating enzyme E2O

–0,860

ST3GAL6

ST3 beta-galactoside alpha-2,3–sialyltransferase 6

–0,860

RGS7BP

Regulator of G-protein signaling 7 binding protein

–0,855

PPP1R1A

 Protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 1A 

–0,854

GLDC

Glycine Dehydrogenase 

–0,847

IRS2

Insulin receptor substrate 2

–0,826

TRPM3

Transient receptor potential cation channel subfamily Member 3

–0,817

LOC100047934

Hhypothetical protein LOC100047934 

–0,814

PROX1

Prospero homeobox protein 1

–0,738

2310067B10RIK

RIKEN cDNA 2310067B10 gene (syn. TMEM94)

–0,696

CRYGC

Crystallin, gamma C

–0,676

CRYGF

Crystallin, gamma F

–0,578

GM129

CIART, circadian associated repressor of transcription

–0,566

TRIB3

Tribbles homolog 3

–0,549

CRYGA

Crystallin, gamma A

–0,567

CRYGE

Crystallin, gamma E

–0,543

CRYGN

Crystallin, gamma N

–0,536