science-review.ru
Макулярный отек в результате нарушения проницаемости гематоретинального барьера достаточно часто является причиной слабовидения и потери зрения у лиц преимущественно трудоспособного возраста при такой патологии сетчатки как диабетическая ретинопатия, влажная форма возрастной макулярной дегенерации и окклюзия вен сетчатки.
В нарушении гематоретинального барьера при каждой из данных патологий важную роль играет васкулоэндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor – VEGF) [21; 23; 45; 56; 65]. Современный уровень развития технологий позволяет на сегодняшний день проводить изучение молекулярно-генетических основ формирования патологии и идентифицировать ключевые регуляторные механизмы, участвующие в наступлении эффектов от проводимого лечения. Изучение молекулярных механизмов влияния VEGF на сетчатку позволит получить дополнительное представление не только о механизмах развития патологии, связанной с этим фактором, но и механизмах проведения лечения (анти VEGF – терапия, лазеркоагуляция) и повышения его эффективности, поможет идентифицировать гены для разработки будущих терапевтических стратегий.
Цель – исследовать изменения экспрессии генов в сетчатке при интравитреальном введении VEGF в эксперименте.
Материалы и методы исследования
Работу проводили на 4–5 недельных самцах мышей линии C57BL/6J.
Результаты исследования генотипа мыши свидетельствуют, что 80 % генов этого животного и человека идентичны и 99 % генов очень похожи, длина генетического кода мыши меньше, чем человека всего лишь на 14 % [16]. В связи с этим лабораторные мыши являются основной моделью для проведения биомедицинских исследований. При проведении исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико – биологических исследований с использованием животных». Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 1996).
Под общим наркозом (внутрибрюшинная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) с помощью шприца Hamilton было произведено интравитреальное введение рекомбинантного VEGF165 (R & D Systems) 50 нг/мл в 2 мкл фосфатно-солевого буферного раствора PBS (6 глаз), в контрольные глаза вводили PBS (6 глаз). Установлено, что через 24 часа после интравитреального введения 50 нг/мл VEGF животным сосудистая проницаемость увеличивается более, чем в 3 раза [41; 53; 62; 76].
Через сутки после введения VEGF выделенные образцы тканей (нейроэпителий, пигментный эпителий) были переданы для транскрипционного анализа в ЗАО «Геноаналитика» (Москва).
Суммарную РНК из выделенных образцов тканей экстрагировали с помощью реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Количество полученной общей РНК оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop (NanoDrop Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. Качество РНК проверяли с помощью чипа Agilent Total RNA Nano 6000 (Agilent Technologies, США). По 400 нг общей РНК каждого образца амплифицировали с помощью Illumina® TotalPrep ™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированную РНК гибридизовали с MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChips (Illumina) в соответствии с протоколом Illumina. Анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения GenomeStudio (Illumina, США), модуля экспрессии генов. Для интерпретации результатов транскрипционного анализа использовали транскрипты с параметром Detection_Pval < 0,01. Результаты считались значимыми при p <0,01.
Результаты исследования и их обсуждение
Регуляция экспрессии генов мембранных белков плотного контакта
Выявлено снижение экспрессии генов мембранных белков плотного контакта Ocln и Cldn –1, –2, –3, –5, –10, – 11 и 19, которые экспрессируются в эндотелии сосудов сетчатки и пигментном эпителии и обеспечивают их барьерные функции [33; 42].
В предыдущих экспериментальных работах было установлено, что в эндотелии сосудов сетчатки снижается экспрессия окклюдина и клаудинов -1 и -3 при использовании VEGF и при экспериментальном аутоиммуном ретините [18; 19; 75]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии, наоборот, было выявлено, что экспрессия клаудинов -1, -2 и -5 увеличивается и полученный результат авторы связывают с формированием неоваскуляризации [39]. На культуре фетальных клеток пигментного эпителия было установлено, что VEGF на экспрессию Cldn -3,- 10 и 19 существенно не влияет [44]. При культивировании клеток пигментного эпителия в условиях высокой концентрации глюкозы и гипоксии снижается экспрессия окклюдина и клаудина-1 [70]. Полученные нами данные могут свидетельствовать о снижении экспрессии генов мембранных белков плотного контакта, как в эндотелии сосудов сетчатки, так и в пигментном эпителии.
Снизилась экспрессия гена Ppap2b (Lpp3), который относится к мембранным гликопротеинам и отвечает за межклеточную адгезию эндотелиальных клеток. Установлено, что при инактивации LPP3 в эндотелии сосудов сосудистая проницаемость увеличивается в 2 раза [43].
Снизилась экспрессия генов Ndst1, кодирующего гепарансульфат и Hs3st3a1, отвечающего за биосинтез гепарансульфата – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки.
В 8 раз увеличилась экспрессия гранулярного мембранного белка – гликопротеина 2 (Gp2), который активирует эндотелиальные клетки и снижает функции эндотелиального барьера.
Регуляция экспрессии генов молекул межклеточной адгезии
Увеличилась экспрессия молекул межклеточной адгезии Icam-1 и 2 в 2,1 и 5,2 раза, Vcam-1 в 3,2 раза, CD44 в 6 раз и хемокина – Cx3cl1 в 3,2 раза, что свидетельствует об усилении процессов межклеточных взаимодействий и клеточной адгезии. Роль молекулы CX3C, принадлежащей к подсемейству хемокинов в формировании сосудистой патологии сетчатки меньше всего изучена, в связи с этим приводим данные только по данной молекуле. Установлено, что CX3CL1 стимулирует неоангиогенез у мышей с кислород-индуцированной ретинопатией, уровень его содержания увеличивается у пациентов в стекловидном теле при пролиферативной диабетической ретинопатии [78], у мышей с экспериментальным диабетом увеличивается уровень его экспрессии в сетчатке [54].
Экспрессия гена St3gal6, который играет ключевую роль в синтезе сиалил-лиганда клеточной адгезии E – селектина, выполняющего важную роль в инициации связывания лейкоцитов с эндотелием снизилась.
Регуляция неоангиогенеза
Увеличилась экспрессия генов Rhbdf1 в 1,5 раза и Psen2 – в 325 раз. Rhbdf1 принадлежит к семейству сериновых протеиназ (ромбоидов), расщепляющих белки, аналогичные эпидермальному фактору роста и в связи с этим обладает антиангиогенными свойствами. Psen2 – пресенилин-2 относится к семейству аспартатных протеиназ, расщепляющих внутримембранные рецепторные белки 1 типа и тоже обладает антиангиогенными свойствами, участвуя в реализации эффектов Notch сигнального пути, блокирующего ангиогенез. Установлено, что при повышении активности Notch сигнального пути формирование лазер-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации блокируется и, наоборот, при его ингибировании активируется [7]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии установлено, что в сетчатке увеличивается уровень экспрессии Psen2 [38] и Rhbdf1 [29].
Увеличилась экспрессия Tsp1 в 1,2 раза. Тромбоспондин-1 – белок внеклеточного матрикса, ингибирует эндотелиальную клеточную пролиферацию, миграцию и ангиогенез. На модели кислород-индуцированной ретинопатии было установлено, что в период активного формирования неоваскуляризации в эндотелии ретинальных сосудов экспрессия TSP-1 увеличивается; при дополнительной VEGF стимуляции наблюдается сначала снижение его экспрессии, затем наоборот, увеличение в 3 раза по принципу отрицательной обратной связи [64].
Повысилась экспрессия гена Igfbp4 – ИФР – связывающего белка, типа 4 в 1,24 раза. Igfbp4, образует комплекс с инсулиноподобным фактором роста 1 и не позволяет ему связаться с «родными» рецепторами на клетках-мишенях, блокируя тем самым его эффект – стимулировать неоангиогенез. На экспериментальной модели кислород-индуцированной ретинопатии различными авторами было выявлено увеличение экспрессии в сетчатке различных типов ИФР – связующих белков. Одни авторы выявили увеличение экспрессии Igfbp2, Igfbp4 и Igfbp5 на фоне низкой экспрессии Igfbp3 и Igfbp6 [71], другие – увеличение экспрессии Igfbp3 более чем в 5 раз в областях формирования неоваскуляризации [35]. У пациентов с непролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией в стекловидном теле выявлено увеличение концентрации Igfbp2 и Igfbp3 в 1,5 и 13 раз, соответственно [40; 46; 60].
Снизилась экспрессия гена Irs2, кодирующего субстрат инсулинового рецептора 2 и участвующего в реализации физиологических функций инсулина и факторов роста [74].
Снизилась экспрессия Egr1, участвующего в передаче сигналов VEGF-A/VEGFR2 и регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, при его блокаде, с использованием NAB2, VEGF-индуцированная экспрессия генов в эндотелиальных клетках снижается и ангиогенез ингибируется [37; 52].
Увеличилась экспрессия уридин-фосфорилазы 1 (Upp1) в 2,6 раза. Уридин-фосфорилаза входит в состав класса пиримидиновых нуклеозидфосфорилаз, катализирует реакцию расщепления гликозидной связи в уридине и обладает выраженными проангиогенными свойствами. Установлено, что в результате блокады уридин – фосфорилазы блокируется лазериндуцированная хориоидальная неоваскуляризация [77].
Регуляция структурных клеточных функций
Повысилась экспрессия 7 генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17 – в 4,8, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14 и Krt 6b, соответственно, в 3,0 -2,7– 2,5– 2,3– 2,2 и 1,5 раза). Промежуточные филаменты играют важную роль в поддержании структурной целостности внутренних слоев сетчатки, особенно клеток Мюллера. При аргон-лазерной коагуляции сетчатки в ганглиозном слое и слое нервных волокон было выявлено повышение уровня экспрессии Krt 1–12 [13]. В сетчатке крыс OXYS (преждевременно стареющие крысы) в возрасте 3 месяцев экспрессия Krt 1–12, наоборот снижается, что с точки зрения автора свидетельствует о нарушении взаимодействий между клетками и внеклеточным матриксом [4].
В 3,1 раза повысился уровень экспрессии муцина 1 (Muc1) – трансмембранного гликопротеина, входящего в состав волокон клеток Мюллера, формирующих наружную и внутреннюю пограничные мембраны и выполняющего функции клеточного протектора [67].
Увеличилась экспрессия гена ядерной ламины (фибриллярный белок) (Lmna), также обеспечивающего структурную функцию.
Экспрессия кальпаина 1 (Capns1) увеличилась в 1,75 раза, установлена его связь с нейродегенеративными процессами и пигментным ретинитом. Кальпаины – Са2+--зависимые цистеиновые протеиназы, осуществляют деградацию белков, являющихся компонентами цитоскелета [4]. Содержатся в нервной ткани в двух формах – растворимой и мембраносвязанной, которая преимущественно ассоциирована с миелином и обнаруживается в синаптических мембранах, расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин и миофибриллярные белки.
Экспрессия белков – кристаллинов – Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf и Сryge, относящихся к группе структурных генов. Функция кристаллинов заключается в защите белков от неправильного сворачивания и аггрегации, т.е. они являются шаперонами. На экспериментальных моделях глаукомы было выявлено наличие снижения экспрессии белков-кристаллинов в сетчатке [8; 47; 61], в сетчатке крыс OXYS экспрессия кристаллинов Сrygb, Crygs, Cryab, Cryba2 и Crygd снижается в 10 раз [4]. На моделях животных при лазерной коагуляции сетчатки, повреждении зрительного нерва и стрептозотоциновом диабете выявлено, наоборот повышение экспрессии кристаллинов [13; 28; 51; 72]. Xi J. с соавт. [73] и Templeton J.P. с соавт. [66] считают, что интерпретировать различия в экспрессии кристаллина в сетчатке следует с осторожностью, так как они значительно варьируются и зависят от инициирующего стимула.
Регуляция процессов клеточной пролиферации транскрипции (построение РНК по комплементарной ДНК) и дифференциации
В обеспечении скоординированного баланса между процессами клеточной пролиферации и дифференциации важную роль играет Hippo – киназный сигнальный путь, одним из компонентов которого является Sav1 (гомолог Салвадор 1, известный также как WW45), находящийся, как и большинство других компонентов этого пути в «спящем» состоянии во взрослом организме. Hippo – киназный сигнальный путь играет решающую роль в процессе ретиногенеза – при активации пролонгирует пролиферацию клеток – предшественников, при дезактивации блокирует [12]. Однако есть данные, что Sav1 может инициировать процесс пролиферации взрослых кардиомиоцитов и усиливать регенерацию кардиомиоцитов после инфаркта миокарда [26; 27]. В нашем случае экспрессия Sav1 снизилась.
Снизилась экспрессия генов супрессоров клеточной пролиферации – некдина (Ndn) и фосфатидилинозитола – 5 -фосфата – 4 – киназы (Pip4k2f) и гена супрессора клеточного деления – Fnip1. Увеличилась экспрессия ингибитора орнитин декарбоксилазы (Oaz1), блокирующего синтез полиаминов, ингибирующего процессы клеточной пролиферации и роста [49] в 1,9 раза.
В 2,1 раза увеличилась экспрессия лизоцима (Lyzs), обычно находящегося в «спящем» состоянии [59], и в 2 раза экспрессия гена активатора транскрипции – фактора Hes1 (Hes1), экспрессируемого обычно в клетках – предшественниках и участвующего в регуляции морфогенеза сетчатки, клеточного цикла и клеточной дифференцировки [22].
Снизилась экспрессия генов активаторов транскрипции – Atmin и Lbh – гена, кодирующего LBH транскрипционный активатор и являющегося регулятором дифференциации фоторецепторов через Otx2 [34] и гена спектрина – бета 1 (Spnb1), участвующего в регуляции процессов транскрипции и дифференциации. В отличие от полученных нами данных, на модели кислород-индуцированной ретинопатии было выявлено, что экспрессия гена Spnb1 в сетчатке увеличивается [29].
Снизилась экспрессия Prox1 – транскрипционного фактора, индуцирующего пролиферацию и дифференцировку биполярных, амакринных и горизонтальных клеток сетчатки в период внутриутробного развития. Снизилась экспрессия гена Egr1, который помимо регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, являясь транскрипционным фактором, играет важную роль в нейрональной активности и пластичности [31]. Повышение уровня его экспрессии в сетчатке, выявленное на стрептозотоциновой модели сахарного диабета свидетельствует о его роли в активации микроглии [20].
Повысилась экспрессия генов – гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ядерных белков, ингибирующих транскрипцию РНК в 1,4 раза. На экспериментальной модели кислород – индуцированной ретинопатии было установлено, что в сетчатке снижается экспрессия генов Hist1h2bk, Hist1h2bc, Hist1h2bp, Hist1h2bl, Hist1h2bj, Hist1h2bm, Hist1h2bn [29].
Регуляция процессов трансляции (синтез белка из аминокислот на матрице информационной, матричной РНК) и процессинга РНК (процесс созревания синтезированной на ДНК преРНК и преобразование её в зрелую РНК)
Экспрессия ингибитора трансляции (Gm11961) – антисмысловой РНК увеличилась в 1,8 раза. Действие антисмысловых РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, в связи с этим они получили название антисмысловых (antisense RNA) или micРНК (mRNA interfering complementary RNA – IncRNA). Антисмысловые РНК образуют гибридные комплексы с комплементарными мРНК и препятствуют формированию трансляционного комплекса [69]. Многочисленные IncRNA играют значительную роль в процессе развития сетчатки [17]. Six3os экспрессируется в клетках – предшественниках сетчатки мыши и человека и контролирует экспрессию фактора транскрипции Six3. Подавление его экспрессии приводит к уменьшению количества биполярных клеток и увеличению количества глиальных клеток Мюллера [10; 14; 50; 79; 80]. Gomafu в процессе развития сетчатки регулирует количество формирования амакриновых и глиальных клеток Мюллера [50].
Увеличилась экспрессия гена Prpf19, отвечающего за процессинг РНК в 1,3 раза и одновременно снизилась экспрессия Sentrin/SUMO специфической протеиназы 3 (Senp3), участвующей в созревании рРНК, SUMO модулирует многие пути передачи сигнала (Wnt, цитокины, ростовые факторы, стероидные гормоны) [1].
Снизилась экспрессия генов Pabpn1 и A2bp1, относящихся к классу РНК – связывающих белков, которые соединяются с большим количеством белков – партнеров и практически со всеми мРНК (осуществляют транспорт мРНК в цитоплазму, проверку ее на «значимость» и определяют путь дальнейших преобразований – деградация, трансляция и ее регуляция) [3].
Регуляция процессов трансмембранного переноса белков и микроэлементов
Повысилась экспрессия гена связанного мембранного белка 1 (Tram1) в 1,5 раза, отвечающего за транслокацию (перенос) белков через мембрану.
Увеличилась экспрессия гена, содержащего NIPA-подобный домен 1 (Npal2), отвечающего за трансмембранный перенос малых молекул и гена, отвечающего за ретроградный транспорт эндосом, окислительный стресс и участвующего в формировании аутосомно-доминантной семейной экссудативной витреоретинопатии (Plekhb2) в 1,5 раза.
Снизилась экспрессия гена Bdh2 (в большом количестве экспрессируется в пигментном эпителии, клетках Мюллера и ганглиозных клетках сетчатки) – ингибитора выработки эндогенной 2,5–дигидроксибензойной кислоты, обеспечивающей трансмебранный (плазматическая и митохондриальная мембраны) перенос железа. Железо участвует в метаболизме холестерина в пигментном эпителии сетчатки и играет роль в формировании возрастной макулярной дегенерации. Установлено, что у мышей с дефицитом протеина HFE (гемохроматоз) снижается экспрессия Bdh2 в клетках сетчатки и увеличивается содержание холестерина [11].
Снизилась экспрессия гена Ccs, выполняющего шаперонную функцию – несущего ответственность за поставку меди в супероксиддисмутазу (СОД), при снижении экспрессии Ccs активность СОД снижается на 70–90 %.
Регуляция процесса передачи сигнала (сигналинг)
Увеличилась экспрессия гена миелоидной дифференцировки Myd88 в 1,36. Myd88 является цитозольным адаптерным белком, участвующим в передаче сигнала от всех толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR) за исключением TLR3 [36]. В результате экспериментальных исследований было установлено, что ингибирование Myd88 в пигментном эпителии сетчатки мышей дает положительный результат в лечении сухой формы AMD.
Увеличилась экспрессия гена кальмомодулина 3 (Calm3), кальцийзависимого сигнального белка в 1,29 раза и незначительно повысилась экспрессия генов, связанных с клеточным сигналингом – Wbpil и Smad4.
Регуляция процессов протеолиза (экстраклеточного, цитоплазматического, протеасомного, лизосомального) и гидролиза
Увеличилась экспрессия гена экстраклеточного протеолиза – матричной металлопротеиназы (Mmp3), отвечающей за деградацию внеклеточного матрикса в 2 раза, цитоплазматического протеолиза – убиквилина 1 (Ubqln1) (установлено, что повышает риск развития болезни Альцгеймера) в 1,45 раза и гена протеасомного протеолиза (Psmd6) в 1,36 раза и снизилась экспрессия гена цитоплазматического убиквитин-протеолиза – Ubeo2o.
Протеасомный (убиквитин-протеасомный) протеолиз – это одна из систем внутриклеточной деградации белков, конъюгированных с убиквитином, участвующих во множестве клеточных процессов, включая регуляцию транскрипции, репарацию ДНК, иммунный ответ и апоптоз [5; 6]. Согласно современным представлениям, протеасомы находятся не только в клетке (ядро, цитоплазма), но и во внеклеточном пространстве. Предполагается, что накопление их в межклеточном пространстве связано с необходимостью «расчистки территории» – избавления от накапливающихся во внеклеточном пространстве белков [9; 58]. За протеасомный протеолиз отвечает многочисленное число генов – Psma6, Psma7, Psma6, Psma7, Psma9 и Psmd13.
Увеличилась экспрессия генов, отвечающих за лизосомальный протеолиз – гюкозидазы (Gaa) в 1,95 раза, лизоцима – аутофагия (Lyzs) в 1,7 раза (установлена связь лизоцима с нейродегенеративными заболеваниями сетчатки) и маннозидазы (Man2b1) в 1,6 раза.
Одновременно увеличилась экспрессия генов, ингибирующих протеолиз, ингибитора трансмембранных сериновых протеиназ (Serpinb3a) в 3,1 раза, ингибитора цистеиновых протеиназ (Stfa1 и Wfdc2) в 1,9 раза и ингибитора пептидазы 16 (Pi16) – в 1,8 раза. Снизилась экспрессия гена Ulk1 – индуктора процессов аутофагии.
Увеличилась экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический гидролиз (Ndrg3) в 1,7 раза.
Снизилась экспрессия Lос100044692 – гена, отвечающего за катаболизм эндогенных альдегидов. Эндогенные альдегиды образуются в процессе перекисного окисления липидов, гликозилирования и окисления радикалов некоторых свободных аминокислот, обладают высокой цитотоксичностью – формируют ковалентно связанные белки – «вторичные цитотоксические мессенджеры» (при взаимодействии альдегидов с аминогруппами лизина формируется липофусцин), которые за счет ингибирования протеолитической активности протеасом (убиквит-зависимый протеолиз) плохо подвергаются протеолизу и накапливаются в клетках, взаимодействуя с мембранами митохондрий тормозят окислительно – восстановительные процессы в дыхательной цепи митохондрий и угнетают тканевое дыхание. К ферментам, катализирующим процесс катаболизма альдегидов, относятся глутатионтрансфераза и альдозоредуктаза, альдегиддегидрогеназа и альдегидредуктаза [2]. Таким образом, в результате снижения экспрессии Lос100044692 нарушается утилизация эндогенных альдегидов.
Регуляция процесса синаптической передачи
Повысилась экспрессия гена Cd63 (трансмембранный белок), отвечающего за экзоцитоз синаптических везикул в 1,43 раза и гена оксистерол-связывающего белка 2 (Osbp2) – одного из ключевых ферментов холестеринового обмена, участвующего в поддержании липидного состава мембран, связывающего оксистеролы и ингибирующего их цитотоксичность в 1,3 раза. Оксистеролы образуются в синаптических мембранах в результате окислительной модификации холестерина, «покидают» мембраны, связываясь с оксистерол-связывающими белками. Увеличилась экспрессия гена Cинаптотагмин I (Syt1) – мембранного белка синаптических везикул, отвечающего за синаптическую передачу [57; 63; 32], способствующего аксональному разветвлению [25] и участвующего в регенерации аксонов [68] в 1,24 раза. На модели аксональной травмы (краш-синдром) зрительного нерва мышей было установлено, что после травмы увеличивается экспрессия Syt1, авторы предполагают, что индукция экспрессии Syt1 может быть обусловлена регенеративной недостаточностью [55].
Снизилась экспрессия гена Syap1 – cинапс – ассоциированного белка 1, отвечающего за синаптическую передачу и гена Trpm3, играющего важную роль в передаче сигналов во внутренних слоях сетчатки [24; 15].
Регуляция митохондриальных функций
В 1,5 раза увеличилась экспрессия сигнальной митохондриальной пептидазы – ген Sec11a.
Одновременно снизилась экспрессия гена Atp5c1, кодирующего субъединицу митохондриальной АТФ – синтазы – катализатора синтеза АТФ, и гена Atpif1, кодирующего ингибитор митохондриальной АТФ – азы – катализатора отщепления от аденозинтрифосфорной кислоты остатков фосфорной кислоты с освобождением энергии, используемой в процессах трансмембранного переноса и биосинтеза различных соединений, что свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма.
Снизилась экспрессия гена, ответственного за высокую точность воспроизведения генетически заданной структуры белков – гена, кодирующего митохондриальный фермент – фенилаланил-тРНК синтетазу (Fars2) и снизилась экспрессия гена Chchd1, кодирующего белок миторибосом (рибосом митохондрий).
Регуляция метаболических процессов
Уровень экспрессии гена цитохрома P450 (Сyp2a5), отвечающего за процессы окисления, гидроксилирования, метаболизма ретинола (катализатор окисления ретиноевой кислоты в 4–гидрокси-ретиноевую кислоту) повысился в 4,0 раза.
Повысилась экспрессия гена фосфатазы 1 (Ppp1ca) в 1,32 раза, участвующего в регуляции различных метаболических процессов. Установлено, что после экспериментального лигирования центральной артерии сетчатки у крысы увеличивается уровень экспрессии Ppp1ca, Ppp3r1 и Ppp1cc [48].
Увеличилась экспрессия гена орнитин-аминотрансферазы (Oat), катализирующей трансаминирование орнитина и альфа-кетоглутарата в пиролин-5–карбоксилат, глутамин или пролин в 1,5 раза; при дефиците орнитин – аминотрансферазы развивается прогрессирующая хорио-ретинальная дистрофия Gyrate [30].
Снизилась экспрессия гена Gldc (декарбоксилаза глицина), катализирующего образование глицина из глиоксилата; увеличивается экспрессия Gldc в ткани сетчатки при стрептозотоциновом сахарном диабете [20].
Регуляция экспрессии факторов роста и стресс-белков (белки острой фазы воспаления)
Снизилась экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов, являющегося низкоаффинным рецептором нейротрофинов (NGF, BDNF, NT3, NT4) и играющего важную роль в регулировке активности нейротрофиновых Trk-рецепторов, в частности, TrkA.
Повысился уровень экспрессии лактоферрина (Ltf), который является белком острой фазы воспаления и регулирует функции иммунокомпетентных клеток – в 3,7 раза.
Выводы
Таким образом, при интравитреальном введении VEGF:
• нарушается барьерная функция эндотелия сосудов сетчатки за счет снижения экспрессии генов мембранных белков плотного контакта (Ocln и Cldn –1, –2, –3, –5, –10, –11 и –19), генов, которые относятся к мембранным гликопротеинам (Ppap2b) и отвечают за биосинтез гепарансульфата (Ndst1, Hs3st3a1) – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки; за счет увеличения экспрессии гена Gp2, снижающего функции эндотелиального барьера и молекул межклеточной адгезии (Icam-1, –2, Vcam-1, CD44, Cx3cl1в); снижение экспрессии гена St3gal6, участвующего в синтезе лиганда клеточной адгезии E – селектина, вероятно, является компенсаторным;
• меняется экспрессия генов, участвующих в регуляции процесса неоангиогенеза – с одной стороны, компенсаторно увеличивается экспрессия генов – ингибиторов неоваскуляризации (Psen2, Rhbdf1, Tsp1, Igfbp4) и снижается экспрессия генов, стимулирующих ангиогенез – Irs2 и Egr1, с другой стороны, увеличивается экспрессия гена Upp1, обладающего проангиогенными свойствами;
• активируется экспрессия генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14, Krt 6b), клеточного протектора Muc1 и ядерного фибриллярного белка Lmna, обеспечивающих поддерживающую структурную функцию и снижается экспрессия Capns1, участвующего в деградации белков – компонентов цитоскелета, одновременно при этом снижается экспрессия белков – кристаллинов (Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf, Сryge), относящихся также к группе структурных генов;
• снижается экспрессия генов – супрессоров клеточной пролиферации (Sav1, Ndn, Pip4k2f, Fnip1) и увеличивается экспрессия гена Oaz1-ингибитора клеточной пролиферации;
• увеличивается экспрессия генов, имеющих отношение к клеточной дифференцировке (Lyzs, Hes1), находящихся обычно во взрослом организме в «спящем» состоянии; блокируются процессы транскрипции за счет снижения экспрессии генов активаторов транскрипции (Atmin, Lbh, Spnb1, Prox1, Egr1) и увеличения экспрессии генов гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ингибиторов транскрипции;
• увеличивается экспрессия ингибитора трансляции – Gm11961 – антисмысловой РНК и регулируется процесс созревания РНК – увеличивается экспрессия гена Prpf19 и снижается экспрессия Senp3, Pabpn1 и A2bp1с;
• активируется экспрессия генов, отвечающих за трансмембранный перенос белков – Tram1, малых молекул – Npal2, за ретроградный транспорт эндосом – Plekhb2 и снижается экспрессия гена Bdh2 – ингибитора трансмембранного переноса железа (активируется перенос железа) и гена Ccs, отвечающего за поставку меди в СОД (снижается активность фермента);
• активируется процесс передачи сигнала – повышается экспрессия генов – Myd88, Calm3, Wbpil и Smad4;
• увеличивается экспрессия генов, отвечающих за экстраклеточный (Mmp3), цитоплазматический (Ubqln1), протеасомный (Psmd6) и лизосомальный (Gaa, Lyzs, Man2b1) протеолиз и гена, активирующего цитоплазматический гидролиз (Ndrg3); одновременно снижается экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический протеолиз – Ubeo2o, индуктора процессов аутофагии – Ulk1 и увеличивается экспрессия генов, ингибирующих протеолиз – Serpinb3a, Stfa1, Wfdc2, Pi16 и Lос100044692;
• регулируется процесс синаптической передачи – одновременно увеличивается – Cd63, Osbp2, Syt1 и снижается – Syap1, Trpm3 экспрессия генов, отвечающих за синаптическую передачу;
• регулируются митохондриальные функции – увеличивается экспрессия гена сигнальной митохондриальной пептидазы – Sec11a, снижается экспрессия генов митохондриальной АТФ – синтазы – Atp5c1, ингибитора митохондриальной АТФ – азы – Atpif1, фенилаланил-тРНК синтетазы – Fars2 – и гена белка миторибосом Chchd1;
• активируется экспрессия генов, отвечающих за метаболизм – Oat, Ppp1ca и Сyp2a5 (метаболизм ретинола) и снижается экспрессия гена, катализирующего образование глицина – Gldc;
• снижается экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов и повышается уровень экспрессии стресс-белка – лактоферрина (Ltf), регулирующего функции иммунокомпетентных клеток.
VEGF, таким образом, помимо того, что играет важную роль в нарушении функции гематоретинального барьера, обладает еще целым рядом эффектов, представление о которых необходимо иметь на сегодняшний день для повышения эффективности лечения офтальмопатологии, сопровождающейся формированием макулярного отека.
Соотношение экспрессии генов в сетчатке мышей линии C57BL/6J в норме и при интравитреальном введении VEGF (p <0,01)
|
Символ |
Название |
Соотношение (Ratio) |
|
1 |
2 |
3 |
|
LOC100041004 (PSEN2) |
Presenilin-2 |
325 |
|
CLDN11 |
Claudin 11 |
14,212 |
|
CLDN1 |
Claudin 1 |
8,205 |
|
GP2 |
Pancreatic zymogen granule membrane protein GP-2 |
8,074 |
|
CD44 |
CD44 antigen |
6,123 |
|
ICAM-2 |
Intercellular adhesion molecule 2 |
5,233 |
|
KRT17 |
Keratin 17 |
4,811 |
|
CYP2A5 |
cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 5 |
4,020 |
|
LTF |
Lactoferrin |
3,758 |
|
VCAM-1 |
Vascular cell adhesion protein 1 |
3,215 |
|
CX3CL1B |
Chemokine (C-X3–C motif) ligand 1 (Fractalkine) |
3,243 |
|
MUC1 |
Mucin 1, cell surface associated |
3,130 |
|
SERPINB3A |
Serine peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 3A |
3,116 |
|
KRT19 |
Keratin 19 |
2,983 |
|
KRT13 |
Keratin 13 |
2,680 |
|
UPP1 |
Uridine phosphorylase 1 |
2,576 |
|
KRT23 |
Keratin 23 (histone deacetylase inducible) |
2,477 |
|
CLDN19 |
Claudin 19 |
2,333 |
|
KRT15 |
Keratin 15 |
2,296 |
|
KRT14 |
Keratin 14 |
2,239 |
|
ICAM-1 |
Intercellular adhesion molecule 1 |
2,151 |
|
LYZ |
Lysozymes |
2,149 |
|
MMP3 |
Matrix metallopeptidase 3 |
2,042 |
|
HES1 |
Transcription factor HES1 (hairy and enhancer of split-1) |
2,011 |
|
GAA |
Acid alpha-glucosidase |
1,952 |
|
WFDC2 |
WAP (whey acidic protein)four-disulfide core domain protein 2 |
1,904 |
|
STFA1 |
Stefin A1 |
1,868 |
|
LOC100045697 (OAZ1) |
Оrnithine decarboxylase antizyme |
1,859 |
|
PI16 |
Peptidase inhibitor 16 |
1,810 |
|
OTTMUSG00000005065 |
syn. Gm11961 (antisense lncRNA gene) |
1,768 |
|
CAPNS1 |
Calpain small subunit 1 |
1,751 |
|
LYZS |
LysozymeS |
1,711 |
|
C130090K23RIK |
RIKEN к ДНК C130090K23 gene |
1,692 |
|
NDRG3 |
N-myc downstream-regulated gene 3 protein |
1,678 |
|
CLDN2 |
Claudin 2 |
1,613 |
|
MAN2B1 |
Mannosidase alpha class 2B member 1 |
1,564 |
|
NPAL2 |
NIPA-Like Domain Containing 2 |
1,541 |
|
PLEKHB2 |
Pleckstrin homology domain-containing family B member 2 |
1,523 |
|
TRAM1 |
Translocation associated membrane protein 1 |
1,521 |
|
KRT6B |
Keratin 6B |
1,494 |
Продолжение табл.
|
1 |
2 |
3 |
|
LMNA |
Lamin A |
1,475 |
|
SEC11A |
SEC11 Homolog A, Signal Peptidase Complex Subunit |
1,468 |
|
OAT |
Ornithine aminotransferase |
1,467 |
|
RHBDF1 |
Inactive rhomboid protein 1 (iRhom1) |
1,463 |
|
UBQLN1 |
Ubiquilin 1 |
1,453 |
|
HIST1H2BF |
Histone Cluster 1,H2bf |
1,440 |
|
CD63 |
CD63 antigen |
1,427 |
|
HIST1H2BJ |
Histone Cluster 1,H2bj |
1,415 |
|
PSMB6 |
Proteasome subunit beta type-6 (subunit beta-1) |
1,365 |
|
MYD88 |
Myeloid differentiation primary response gene 88 |
1,364 |
|
PPP1CA |
Protein phosphatase 1, catalytic subunit, alpha isoform |
1,321 |
|
PRPF19 |
Pre-mRNA-processing factor 19 |
1,306 |
|
CALM3 |
Calmodulin 3 |
1,294 |
|
OSBP2 |
Oxysterol-binding protein 2 |
1,294 |
|
OCLN |
Occludin |
1,259 |
|
CLDN10 |
Claudin 10 |
1,251 |
|
CLDN3 |
Claudin -3 |
1,248 |
|
SYT1 |
Synaptotagmin I |
1,239 |
|
IGFBP4 |
Insulin-like growth factor-binding protein 4 |
1,236 |
|
TSP1 |
Thrombospondin-1 |
1,228 |
|
D19WSU162E (WBP1L) |
WW domain binding protein 1–like |
1,181 |
|
CLDN5 |
Claudin 5 |
1,173 |
|
LOC100048076 (Smad4) |
Similar to MAD (Mothers against decapentaplegic) homolog 4 |
0,805 |
|
PPAP2B |
Lipid phosphate phosphohydrolase 3 |
–1,487 |
|
HNRPL |
Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein L |
–1,139 |
|
LOC100044692 |
Similar to aldehyde reductase |
–1,139 |
|
PABPN1 |
Polyadenylate-binding nuclear protein 1 |
–1,131 |
|
NDN |
Necdin |
–1,127 |
|
ATP5C1 |
ATP synthase |
–1,126 |
|
ATPIF1 |
ATPase inhibitory factor 1 |
–1,126 |
|
SAV1 |
Salvador homolog 1 |
–1,122 |
|
SYAP1 |
Synapse-associated protein 1 |
–1,110 |
|
PIP4K2A |
Phosphatidylinositol-5–phosphate 4–kinase type-2 alpha |
–1,110 |
|
CHCHD1 |
Сoiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 1 |
–1,109 |
|
ATMIN |
ATM Interactor |
–1,105 |
|
ACD |
Adrenocortical dysplasia protein homolog |
–1,100 |
|
SENP3 |
Sentrin/SUMO (Small ubiquitin-like modifier)-specific protease 3 |
–0,993 |
|
NGFRAP1 |
Nerve growth factor receptor |
–0,991 |
|
D9ERTD392E |
D9ERTD392E, syn. CCPG1 – cell cycle progression 1 |
–0,979 |
|
LBH |
Limb bud and heart development (LBH-like) |
–0,976 |
|
FARS2 |
Phenylalanyl-tRNA synthetase |
–0,970 |
|
SPNB1 |
Spectrin beta 1 |
–0,968 |
|
FNIP1 |
Folliculin Interacting Protein 1 |
–0,965 |
|
A2BP1 |
Ataxin 2–binding protein 1 |
–0,955 |
|
ULK1 |
Serine/threonine-protein kinase |
–0,945 |
|
TXNDC15 |
Thioredoxin domain-containing protein 15 |
–0,943 |
|
EGR1 |
Early growth response protein 1 |
–0,938 |
|
CCS |
Сopper chaperone for superoxide dismutase |
–0,937 |
|
COL6A1 |
Collagen alpha-1(VI) chain |
–0,932 |
|
4933407N01RIK |
RIKEN cDNA 4933407N01 gene |
–0,929 |
Окончание табл.
|
1 |
2 |
3 |
|
BDH2 |
3 Hydroxybutyrate Dehydrogenase, type 2 |
–0,892 |
|
NDST1 |
N-deacetylase/N-sulfotransferase (heparan glucosaminyl) 1 |
–0,889 |
|
LOC216443 |
Methionyl-tRNA synthetase |
–0,874 |
|
HS3ST3A1 |
Heparan sulfate-glucosamine 3–sulfotransferase 3A1 |
–0,869 |
|
UBE2O |
Ubiquitin-conjugating enzyme E2O |
–0,860 |
|
ST3GAL6 |
ST3 beta-galactoside alpha-2,3–sialyltransferase 6 |
–0,860 |
|
RGS7BP |
Regulator of G-protein signaling 7 binding protein |
–0,855 |
|
PPP1R1A |
Protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 1A |
–0,854 |
|
GLDC |
Glycine Dehydrogenase |
–0,847 |
|
IRS2 |
Insulin receptor substrate 2 |
–0,826 |
|
TRPM3 |
Transient receptor potential cation channel subfamily Member 3 |
–0,817 |
|
LOC100047934 |
Hhypothetical protein LOC100047934 |
–0,814 |
|
PROX1 |
Prospero homeobox protein 1 |
–0,738 |
|
2310067B10RIK |
RIKEN cDNA 2310067B10 gene (syn. TMEM94) |
–0,696 |
|
CRYGC |
Crystallin, gamma C |
–0,676 |
|
CRYGF |
Crystallin, gamma F |
–0,578 |
|
GM129 |
CIART, circadian associated repressor of transcription |
–0,566 |
|
TRIB3 |
Tribbles homolog 3 |
–0,549 |
|
CRYGA |
Crystallin, gamma A |
–0,567 |
|
CRYGE |
Crystallin, gamma E |
–0,543 |
|
CRYGN |
Crystallin, gamma N |
–0,536 |
Библиографическая ссылка
Гаврилова Н.А., Гаджиева Н.С., Комова О.Ю., Филиппова Э.В., Горемыкина Н.Б. ИЗМЕНЕНИЯ ТРАНСКРИПТОМА СЕТЧАТКИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ПРИ ИНТРАВИТРЕАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ VEGF // Научное обозрение. Медицинские науки. – 2016. – № 6. – С. 36-47;URL: https://science-medicine.ru/ru/article/view?id=941 (дата обращения: 23.11.2024).